生物细胞的定义(6篇)
生物细胞的定义篇1
【关键词】胶质瘤；细胞周期检测点激酶；反义寡核苷酸；放射敏感性
TransfectionofChk1AntisenseOligonucleotidetoGliomaIncreasestheApoptoticSensitivitytoIrradiation/LIYong，LAIRun-long，TANDian-hui，etal.//MedicalInnovationofChina，2012，9(13)：003-005
【Abstract】Objective：EffectonexpressionofChk1andchangesofcellcycleafterradiationinU251celllinewithantisenseoligodeoxynucleotide(ASON)wereobserved.Methods：TheU251celllinewastransfectedwithChk1senseandantisensechain-lipofectaminePLUScomplex.ThenirradiateditandmeasuredthechangesofthecellcycleandapoptosisinordertocomparethediferencebetweentheChk1senseandantisensechain.TheexpressionofChk1wasmeasuredbyWesternblot，andChk1mRNAwasmeasuredbyrealtimePCR.Results：TheexpressionofChk1proteinandmRNAmarkedlydecreasedafterransfectingU251celllinewithChk1antisenseoligonucleotide.TransfectingU251celllinewithChk1antisenseoligonucleotidecouldincreaseapoptosissignificantlyanddecreasecellcyclearrestmarkedlyinducedbyirradiation.Conclusion：ThesensitivitytoapoptosisisexcessivelyincreasedaftertreatedwithirradiationbytransfectionofChk1antisenseoligonucleotidetoglioma.Thiscanbethetheoreticalbasisforincreasingtheapoptoticsensitivitytoirradiationofglioma.
【Keywords】Glioma;Checkpointkinase;Antisenseoligonucleotide;Irradiation
First-author’saddress：FirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege，Shantou515041，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.13.002
目前研究认为，细胞周期检测点信号传导通路主要由ATM/ATR-Chk1/2-Cdc25A、Cdc25B、Cdc25c-Cdk轴组成[1]，Chk1是细胞周期检测点信号中最关键的效应蛋白激酶[2]。反义封闭Chk1激酶导致肿瘤细胞产生G2/M期检测点功能障碍，使细胞受损的DNA无法正常修复而更多地凋亡，从而增加肿瘤放、化疗的敏感性[3]。本课题利用反义基因技术抑制胶质瘤细胞中Chk1蛋白表达，消除照射后细胞周期阻滞，探讨其对胶质瘤放射敏感性的影响。
1材料与方法
1.1实验材料和试剂本课题采用人胶质母细胞瘤U251细胞株，由武汉大学典型物保藏中心提供。Chk1鼠抗人单克隆抗体购自美国SantaCruz公司；胎牛血清，DMEM和RPMI1640培养基为Gibco公司产品；LipofectamineTMandPlus脂质体转染试剂盒购自Invitrogen公司；MTT、碘化丙啶(PI)购自Sigma公司；AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒购自BD公司；辣根过氧化物酶偶联羊抗鼠IgG抗体和FITC标记羊抗鼠IgG购自武汉凌飞科技公司；哺乳动物蛋白提取试剂盒、蛋白定量检测试剂盒和Western杂交显影用增强化学发光试剂盒购自Pierce公司；逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶购自MBI公司；Chk1、β-actinTaqman探针购自美国Invitrogen公司；实时定量PCR试剂盒ExScriptRT-PCRKit为日本Takara公司产品。
1.2方法
1.2.1Chk1反义寡核苷酸的合成Chk1的正、反义寡核苷酸链[4]及FITC标记链经全程硫代磷酸修饰，由上海生物技术有限公司合成。Chk1反义寡核苷酸链碱基序列：5’GGCACTGCCATGACTCCA3’，正义寡核苷酸链碱基序列：5’TGGAGTCATGGCAGTGCC3’。
1.2.2U251细胞培养及转染U251胶质瘤细胞复苏后加入RPMI1640培养基中培养至对数生长期，胰蛋白酶消化后胞沉淀用RPMI1640完全培养基悬浮后移入培养瓶，台盼蓝染色细胞计数，调整接种浓度为1×105/ml~1×106/ml，置入5%CO2，37℃湿化培养箱中培养。实验共分四组：(1)正常组：细胞株未作任何处理；(2)对照组：U251细胞10Gy射线照射24h；(3)转染Chk1正义寡核苷酸组；(4)转染Chk1反义寡核苷酸组；(3)~(4)组转染24h后再用(2)组的照射方式处理。培养的细胞株分别进行FITC标记的全硫代修饰的Chk1正、反义寡核苷酸的脂质体法转染，转染后的细胞继续在含胎牛血清的RPMI-1640中继续培养。
1.2.3WesternBlot检测Chk1蛋白取上述各组收集的U251细胞，提取总蛋白。电泳前将样品与缓冲液混合后煮沸5min，作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过电转移法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭1h，鼠抗人一抗Chk1及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗37℃各孵育1h，最后用化学发光底物进行发光显迹。
1.2.4实时定量PCR法(Real-TimePCR)检测Chk1mRNA表达对上述各组处理的细胞提取总量RNA，并测定RNA的含量。以RNA为模板逆转录成cDNA，进行PCR反应，以β-actin为内参照。根据GenbankDatabase中Chk1基因的mRNA序列，应用PrimerExpress2.0设计软件针对Chk1和内参β-actin设计引物和Taqman探针序列。RealTimePCR反应条件如下：预变性：95℃10s；循环：95℃5s60℃34s，共40循环。结果采用Rotorgene3000型实时荧光定量PCR仪自带程序用双标准曲线法分析Ct(Cyclethreshold)值。Chk1及β-actin的PCR引物序列见表1。
1.2.5检测细胞凋亡及细胞周期细胞经上述各组处理后，观察各组细胞漂浮情况，在细胞周期阻滞最显著时间前后收获各组肿瘤细胞，严格按照AnnexinV/FITC-PI凋亡检测试剂盒上的说明操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。
1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，计量资料以(x±s)表示，采取t检验，以P
2结果
2.1反义封闭Chk1基因对Chk1mRNA及蛋白表达的影响实时定量PCR检测发现与空白对照组相比，反义封闭Chk1基因对Chk1在mRNA水平有下调作用，下调率为空白对照组的11%(见图1)，差异有统计学意义(P
图1Real-TimePCR检测转染后Chk1mRNA相对转录水平
图2WesternBlot检测转染后Chk1蛋白产物
图3WesternBlot检测转染后Chk1蛋白相对表达水平
2.2反义封闭Chk1基因对放疗作用下细胞周期和凋亡的影响细胞株经各组处理后，镜下观察细胞漂浮情况，发现转染反义寡核苷酸组较转染正义寡核苷酸组和未处理组的漂浮细胞明显增多，而转染正义寡核苷酸组和未处理组漂浮细胞无明显差别。收获各组肿瘤细胞进行AnnexinV染色后检测细胞凋亡情况，发现转染Chk1反义寡核苷酸后放射线诱导的AnnexinV凋亡率为(35.25±3.75)%，明显高于转染Chk1正义寡核苷酸组的(14.90±1.80)%，差异具有统计学意义(P
U251细胞未处理组G2/M期细胞占(20.76±1.75)%，放疗后出现G2/M期阻滞占(76.35±3.46)%，经放射处理后，细胞被阻滞在G2/M期。转染Chk1反义寡核苷酸组的细胞凋亡率为(16.16±2.89)%，明显高于转染Chk1正义寡核苷酸组(9.70±0.76)%(P
3讨论
细胞周期检测点激酶Chk1是DNA损伤修复通路中最重要的蛋白激酶，主要参与G2/M期细胞周期检测点信号传导通路的调控[3]。目前已有大量研究证实Chk1与人白血病细胞、乳腺癌MCF-7细胞、HeLa细胞、头颈鳞癌A253细胞的放、化疗敏感性密切相关[5-8]，然而Chk1与胶质瘤放疗敏感性的关系尚未见大量报道。本研究发现，接受射线照射后U251胶质瘤细胞主要表现为G2/M期阻滞。照射后肿瘤细胞产生的G2/M期阻滞与其DNA损伤修复有关，G2/M期阻滞为照射后受损伤的肿瘤细胞修复创造条件，而肿瘤细胞的损伤修复降低了放射线对肿瘤细胞的杀灭效应，从而导致放疗抵抗。
反义脱氧寡核苷酸(AsODN)是一种人工合成的单链DN段，根据碱基互补配对原理，能与特定的靶mRNA互补结合，选择性地封闭特定的靶基因，高度特异性的抑制靶基因的翻译与表达[9]。本实验合成的Chk1反义寡核苷酸，以全程硫代修饰增加反义寡核苷酸的稳定性，防止其在细胞外被RNA酶降解，并以脂质体法优化细胞的转染条件，提高其转染效率。Real-TimePCR检测发现，Chk1反义寡核苷酸对Chk1在mRNA水平有明显下调作用，WesternBlot检测结果与此相一致，转染Chk1反义寡核苷酸后同样可明显抑制Chk1蛋白的表达，以上结果表明，特异性灭活Chk1基因可显著增敏放射线诱导的U251肿瘤细胞凋亡。
本课题在特异性灭活Chk1基因对放疗作用的U251肿瘤细胞周期影响的研究中发现，Chk1反义寡核苷酸选择性封闭Chk1基因表达后，放射线诱导的肿瘤细胞G2/M期阻滞消失，细胞分裂周期被重新启动，同时细胞凋亡率显著增强，这进一步证明了选择性反义封闭Chk1基因能明显增加肿瘤细胞对放射线的敏感性。有研究发现，用Chk1抑制剂UCN-01处理U87胶质瘤细胞株后能阻断TMZ诱导的Chk1基因的短暂表达增强和肿瘤细胞的G2/M期阻滞，从而增加肿瘤细胞的凋亡[10]，这说明选择性抑制Chk1基因能增加U87细胞对化疗药物的敏感性。以上结果说明，Chk1基因在放、化疗中引起的肿瘤细胞G2/M期阻滞在细胞周期检测点信号途径中的作用是一致的，因此，特异性的反义封闭或抑制Chk1基因不仅能增敏肿瘤细胞的放疗敏感性，对其化疗敏感性亦有同样的作用。
放疗在杀伤肿瘤细胞的同时也会激活其内在的细胞周期检测点信号途径，增强细胞对放射治疗的抵抗性，寻找针对细胞周期检测点激酶Chk1的特异性抑制剂以提高肿瘤细胞对放疗的敏感性，正成为肿瘤治疗的一个重要研究方向，对未来肿瘤的基因治疗具有重要意义。Chk1基因在信号传导途径中因其对细胞损伤的修复作用，近年成为肿瘤治疗的新靶点，反义核苷酸技术为高选择性、高特异性地抑制Chk1靶点的功能提供了有力保证，选择性抑制Chk1基因为增强胶质瘤放射治疗的敏感性提供了理论依据。
参考文献
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生物细胞的定义篇2
1DPSC的定义和基本生物学性质
成牙本质细胞是一种终末细胞，不具备进一步分化的能力，因此，一般认为成牙本质细胞在遭受损伤后，牙髓内的某些具有分化功能的前体细胞可进一步分化为成牙本质细胞，并分泌相关细胞基质，修复受损组织，这种前体细胞即为DPSC。DPSC具有较强的增殖能力和较高的分化潜能，正是这两种生物学性质，决定了DPSC在牙源组织修复和骨性修复方面具有重要的作用〔2〕。Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓内可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓细胞命名为DPSC，研究人员应用酶消化法对成人第三磨牙的牙髓细胞进行培养，并与骨髓间充质干细胞进行比较，结果显示:这两种细胞具有极为相似的免疫学特性，并且，该研究进一步证实DP-SC经体外诱导后，可形成高密度的钙化小结，将DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)支架复合后移植到小鼠背侧皮下，经过一段时间后，能观察到类似于牙本质-牙髓复合体样的结构。
2DPSC的多向分化潜能
作为一种成体干细胞，DPSC具备多向分化的潜能，这种潜能不仅仅局限在骨性分化方面，研究人员在成脂分化、神经分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生医学研究领域有着重要的指导意义。
2.1DPSC的骨性分化DPSC的骨性分化是关于DPSC定向分化研究较早的一项内容，近些年来，又有了进一步的发展。Mori等〔4〕采用成骨分化培养基进行对DPSC的骨性诱导分化，结果发现，某些典型成骨细胞基因，如:碱性磷酸酶、I型胶原、骨桥蛋白等均大量表达;应用微阵列及RT-PCR技术进一步研究发现，在成骨分化过程中，胰岛素样生长因子结合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受体相关基因(NURR1)均发生表达上调现象，这一机制在成骨分化过程中有着重要的意义。D''''Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨诱导过程中，加入血管内皮生长因子，结果显示:这种方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促进了成骨分化的进程。
2.2DPSC的神经分化DPSC来源于胚胎时期的神经脊，在神经分化方面具备一定的潜能。Király等〔6〕采用低温损伤的方法制备3日龄Wistar大鼠脑缺损模型，于颅内注入DPSC进行修复，研究发现:DPSC趋向分布于室下区、胼胝体下区等神经系统祖细胞区，并表达微管蛋白(N-tubulin)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)等神经细胞标志，对损伤部位有一定的修复作用，并且具有神经系统相关细胞的电压依从性。因此，该结果进一步显示，DPSC在脑损伤体内修复方面，可以作为一种有效的修复细胞。Karaz等〔7〕研究表明:DPSC不仅可以分化为神经干细胞，而且在分化能力方面，高于传统的骨髓间充质干细胞。
2.3DPSC的成脂分化除成骨分化、神经分化方面，成脂分化也是DPSC的一项重要潜能。Nozaki等〔8〕于成脂培养基中加入胰岛素、地塞米松等诱导成脂，经过一段时间的作用，可见细胞中有脂滴的形成，并且在分化过程中多能性标记转录因子(Oct3/4、Sox2)均呈现下调趋势，Nanog基因无显著变化;通过基因微阵列分析，研究人员进一步发现:过氧化物酶体增生物激活受体信号通路的多种组分，均发生变化。所以，对这些基因的调控，在细胞成脂分化过程中有着重要意义。
3DPSC的分化诱导因素
在细胞分化的过程中，分化方向、分化程度、分化速度均会受到一系列物化因素、生物因素的影响，协调各方面因素对控制细胞定向分化有着重要意义。Ito等〔9〕将犬类的DPSC与不同的支架材料相结合，并用这种结合物治疗骨缺损，结果发现不同的支架材料，修复效果会有较大差异，其中DPSC/富血小板血浆(PRP)复合物具备较好的修复效果。Galler等〔10〕将DP-SC接种于水凝胶支架上，并将复合物移植到经过次氯酸钠(NaClO)、乙二胺四乙酸(EDTA)处理过的牙本质内部，培养6w后，发现经NaClO处理的牙本质与复合物结合较好，接触面形成大量细胞陷窝;经乙二胺四乙酸(EDTA)处理的牙本质可以诱导进一步DPSC向成牙质细胞分化，进一步表达牙本质涎蛋白，提高牙本质的修复速度。Yang等〔11〕以大鼠DPSC为研究对象，在常规成骨分化培养基中添加白细胞介素β(IL-1β)，结果显示，细胞的骨唾液蛋白、牙本质基质蛋白等矿化物质的表达均上调，体内实验也得到了相似结果，可见，IL-1β在成骨矿化过程中有一定的促进作用。骨形态发生蛋白在诱导成骨方面有着重要作用，Liu等〔12〕分离扩增家兔DPSC后，将这种种子细胞接种在羟基磷灰石、胶原等支架材料上，并用骨形态发生蛋白II进行刺激处理，结果成骨速度明显提高，最后制备的复合物更有利于体内移植和组织修复。
4DPSC的重编程与再分化
2006年，Takahashi等〔13〕将4个转录因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)导入已处于终末分化状态的小鼠成纤维细胞中，从而获得了一种类似于胚胎干细胞的多能性细胞，称为“诱导性多能干细胞”(inducedpluripotentstemcells，iPScells)。这种方法可以非常稳定的制造多能干细胞，引起了极大的关注。继此之后，人类体细胞被成功诱导为iPS的报道〔14〕和老年人皮肤成纤维细胞被诱导为iPS细胞亚群的报道〔15〕相继出现，这种细胞被认为是一种极具前景的干细胞。体细胞通过一定诱导方式，转变为iPS细胞亚群的过程称为“重编程”;iPS经过定向诱导，再次分化为其他种类细胞的过程，称为“再分化”。DPSC作为一种可以快速自我更新的成体干细胞，同样具备重编程和再分化的潜能。Yan等〔16〕采用逆转录病毒介导法，将4个因子(Lin28/Nanog/Oct4/Sox2或c-Myc/Klf4/Oct4/Sox2)导入DPSC中，将DPSC重编程为iPS细胞亚群。DPSC来源的iPS细胞亚群表达阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TRA)-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等表面标记，具备多向分化的潜能，可分化成3个胚层的组织，而且可被定向诱导分化为神经干细胞和神经元。Tamaoki等〔17〕对多株DPSC进行重编程诱导，结果显示不同株的DPSC在重编程效率方面会有很大差别，不同株DPSC来源的iPS细胞亚群的再分化能力也有较大不同。因此，建立一种高效安全的重编程模式和再分化方法，仍是干细胞领域的研究热点。
生物细胞的定义篇3
一、教学目的要求
(一)要求学生比较系统地掌握关于细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等方面的基础知识，以及这些知识在农业、医药、工业、国防上的应用。
(二)通过生物学基础知识的学习，使学生受到辩证唯物主义和爱国主义思想的教育。
(三)要求学生掌握使用高倍显微镜，做简单的生理实验等的基本技能。
(四)培养学生自学生物学知识的能力，观察动植物的生活习性、形态结构、生殖发育的能力，分析和解释一些生物现象的初步能力。
二、确定教学内容的原则
(一)从学生今后进一步学习和参加社会主义现代化建设的需要出发，认真选取生物学基础知识：选取生物的结构和生理的知识。结构知识是理解生理知识的基础。生理知识是阐明生物的新陈代谢，生长、发育和生殖等的基础知识。因此，必须重视选取形态结构和生理的知识。
(二)选取生物学基础知识，必须做到理论密切联系实际。
1.选取生物学基础知识，要密切联系工农业生产实际。生物学是农业、畜牧业和医学等方面实践的理论基础，通过学习生物学知识，要使学生知道生物与生产的关系十分密切，应该利用和改造有益的生物，防除有害的生物。
2.要密切联系各地的自然实际。由于我国幅员广大，各地的生物种类有很大差别。因此，所选取的植物和动物，既要重视其典型性，又必须尽可能是各地比较常见的，以便学生可以直接观察到这些动植物和了解这些动植物的生活规律。
3.选取的生物学基础知识，要密切联系学生的日常生活实际，使学生加深对生物学知识的理解，同时更加深刻地认识学习生物学的意义。
(三)适当选取反映现代生物科学水平的生物学基础知识。
现代生物科学发展很快，生物课必须重视用现代生物科学的观点来阐述教学内容，并且适当地增加反映现代生物科学水平的知识内容，使学生对生物科学发展的现状有个初步的认识，为他们进一步学习现代生物科学知识和参加工农业生产打下必要的基础。
三、班级现状分析
本学期我任教高二（2）、（3）、（4）三个班级，三个班级人数分别为：46、45、46人，虽然通过班主任，我对个班的现状有了一点了解，但由于生物是从高二开始的起始课程，所以具体情况还不能下定论。
四、教学进度安排
高中阶段学习的生物学知识，是在初中生物教学内容的基础上进行的，学习生物的基本特征，侧重于生命活动的共同规律的内容。主要包括细胞、新陈代谢及其调节、生殖和发育、遗传和变异的知识。初中和高中两个阶段所学的生物学基础知识，既有所分工、又互相衔接，高中生物学是初中生物学知识的综合、概括和提高。
高中二年级开设的生物必修课（第一学期），每周2课时，共计34课时。讲述细胞、生物的新陈代谢、生物的生殖和发育、生命活动的调节、遗传和变异等生物学基础知识。
五、教学内容及其课时安排
高中生物必修课教学进度
单元
知识
学生实验
课时
要点
教学要求
项目
绪论
生物的基本特征
生物科学的新进展
高中生物课学习的要求和方法
B
A
A
2
生命的物质基础
组成生物体的化学元素
组成生物体的化合物
B
C
实验：显微镜的结构和使用；生物组织中还原糖、脂肪、蛋白质的鉴定。
2+1+1
生命的基本单位-细胞
细胞主要的亚显微结构和功能
细胞周期
细胞分裂
B
C
A
实验：
1．颤藻和水绵细胞的比较观察
2．植物细胞的有丝分裂。
2+1+2+1
生物的新陈代谢
光合作用的发现，光合作用及其重要意义
根对水分的吸收和利用
植物的矿质营养
动物的营养
呼吸作用
A
B
B
B
B
实验：
1．叶绿体色素的提取和分离
2．植物细胞的质壁分离与复原。
2+5
应激性和生命活动的调节
植物生命活动的调节
高等动物的激素调节
高等动物的神经调节
A
A
B
1+1+2
生殖和发育
减数分裂和配子的形成
A
2
具体教学内容如下：
绪论
生物的基本特征(细胞结构，新陈代谢，生长现象，应激性，生殖和发育，遗传和变异，生物与环境的相互影响)的概述。
生物学的研究对象和发展方向。学习生物学的重要意义。
说明：生物学的研究对象和发展方向，只要求学生作一般了解。
一、细胞
细胞的发现。细胞学说。原生质的概念。
细胞的化学成分：水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。
细胞的结构和功能：原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体、内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。一个细胞是一个有机的统一整体。细胞的分裂：无丝分裂。有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。
〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，初步学会使用高倍显微镜。
说明：在《细胞》中，以下内容只要求学生作一般了解。
1.细胞的发现，细胞学说，原生质的概念。
2.内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。
3.无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式有有丝分裂。
二、生物的新陈代谢
新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。
绿色植物的新陈代谢：水分代谢——细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水；细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。渗透吸水的原理。渗透作用的概念。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。
矿质代谢——植物需要的元素(大量元素和微量元素)。根吸收矿质元素的过程——交换吸附。植物对离子的选择吸收。矿质元素的利用。
光合作用——光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应，暗反应)。ATP(三磷酸腺苷)的简式，ATP与ADP(二磷酸腺苷)的相互转变。
呼吸作用——呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。
动物的新陈代谢：体内细胞的物质交换——单细胞动物与外界环境直接进行物质交换；多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。
物质代谢——食物的消化(单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。哺乳动物的消化过程概述)。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。
能量代谢——气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。
新陈代谢的基本类型：同化作用的两种不同类型(自养型、异养型的概念和特点)。异化作用的两种不同类型(需氧型、厌氧型的概念和特点)。
〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。
(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。
(3)叶绿体中色素的提取和分离。
说明：1.在《生物的新陈代谢》中，以下内容只要求学生作一般了解。
(1)细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。*渗透作用的概念。
(2)根吸收矿质元素的过程——交换吸附。
*(3)植物对离子的选择吸收。
(4)呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。
(5)单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。
(6)单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。
三、生命活动的调节(4∶0)
植物生命活动的调节：生长素的发现。植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。
动物生命活动的调节：高等动物的激素调节(甲状腺激素、性激素、生长激素的分泌部位和生理作用)。昆虫的激素调节(内激素、外激素的分泌部位和生理作用，昆虫激素在生产上的应用)。神经调节(神经系统的调节功能)。≤第一范文网整理该文章，版权归原作者、原出处所有≥
说明：在《生命活动的调节》中，以下内容只要求学生作一般了解。
*1.生长素的发现。
*2.昆虫的激素调节。
四、生物的生殖和发育(9∶0)
生物的生殖。生殖的概念。
生殖的种类：无性生殖(分裂生殖，孢子生殖，出芽生殖，营养生殖)；有性生殖(配子生殖中的卵式生殖)。这些生殖方式的特点和概念。
减数分裂与有性生殖细胞的成熟：减数分裂的概念和意义。精子的形成过程。卵细胞的形成过程。受精作用的概念和意义。
生物的发育。发育的概念。
植物的个体发育(以荠菜为例)：胚的发育过程，胚乳的发育过程。
动物的个体发育(以蛙为例)：胚的发育过程(包括卵裂、囊胚、原肠胚各期)，各种组织、器官和系统的形成。胚后发育。胚的发育与环境的关系。
说明：在《生物的生殖和发育》中，以下内容只要求学生作一般了解。
*1.生殖的种类。
*2.无性生殖和有性生殖方式的特点和概念。
*3.植物的个体发育(以荠菜为例)。
1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
（一）生命的基础
细胞的化学成分——水，无机盐，糖类，脂类，蛋白质，核酸；上述物质特别是蛋白质和核酸的重要作用，构成细胞的化学元素。
原核细胞和真核细胞的区别。真核细胞的亚显微结构——细胞膜，细胞质(其中含有线粒体、质体)，细胞核(核膜、核仁、核液和染色质)。细胞各个组成部分的功能。
有丝分裂——细胞周期；细胞的分裂期分为前期、中期、后期、末期，各个分裂期的细胞核结构变化的特点。动物细胞和植物细胞的有丝分裂过程的异同。有丝分裂的重要意义。
2.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：
内质网、核糖体、高尔基体、中心体等细胞器。一个细胞是一个有机的统一整体。
无丝分裂。减数分裂是一种特殊方式的有丝分裂。
3.〔实验〕用高倍显微镜观察植物细胞的有丝分裂，学会使用高倍显微镜。
(二)生物的新陈代谢(5∶2)
1.在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
新陈代谢的概念。同化作用和异化作用的概念。
细胞在形成液泡以后主要靠渗透吸水。质壁分离和质壁分离复原。水分散失的方式和意义。植物需要的元素(大量元素和微量元素)。矿质元素的利用。
光合作用的重要意义。高等植物叶绿体中的色素及其作用。光合作用的过程(光反应、暗反应)。ATP(三磷酸腺苷)的简式，ATP与ADP(二磷酸腺苷)的相互转变。
呼吸作用与光合作用的本质区别。呼吸作用的生理意义。
多细胞动物(如哺乳动物)的体内细胞通过内环境与外界环境间接进行物质交换。
哺乳动物的消化过程概述。营养物质的吸收(小肠在形态结构上适于吸收的特点，营养物质的吸收过程)。物质代谢的过程(糖类代谢、蛋白质代谢的过程概述)。
气体交换(单细胞动物和多细胞高等动物进行气体交换的特点)。能量的释放、转移和利用。高等动物在缺氧状态下通过无氧呼吸获得能量。
3.在高中二年级生物课中作为一般了解的以下教学内容，要求达到掌握：
细胞在形成液泡以前靠吸胀作用吸水。渗透吸水的原理。
根吸收矿质元素的过程——交换吸附。
呼吸作用的过程(有氧呼吸和无氧呼吸的过程)。有氧呼吸的过程与无氧呼吸的过程的异同。单细胞动物与外界环境直接进行物质交换。
单细胞动物、低等的多细胞动物、高等的多细胞动物消化食物的特点。
4.〔实验〕(1)观察植物细胞的质壁分离和复原。
(2)观察根对矿质元素离子的交换吸附现象。
(3)叶绿体中色素的提取和分离。
(三)生命活动的调节(2∶0)
在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
植物的向光性和向光性形成的原因。生长素的生理作用及其在实践上的意义。
高等动物的激素调节(甲状腺激素、性激素、生长激素的分泌部位和生理作用)。神经调节(神经系统的调节功能)。
(四)生物的生殖和发育(3∶0)
共2页,当前第1页1
在高中二年级学习高中生物知识的基础上，以下内容要求掌握：
生物的生殖。生殖的概念。
减数分裂的概念和意义。精子的形成过程。卵细胞的形成过程。受精作用的概念和意义。
生物的发育。发育的概念。
五、提高教学质量的具体措施
1、认真抓好生物学基础知识的教学。
高中生物学的知识，内容比较系统、全面。在课前要认真分析教材，掌握教材的重点、难点，研究学生的生理、心理的特点和学习规律，通过课堂教学、实验、课外作业等各个教学环节，努力培养学生的学习兴趣，启发学习的自觉性，在充分调动学生积极性的情况下，引导他们认真学好生物学基础知识，做到正确理解，巩固记忆，举一反三，为他们今后进一步学习有关专业知识和参加工作打下较好的知识基础。
2、重视对学生进行思想教育。
高中生物学的教学内容，十分重视对学生进行进化观点和生态学观点的教育。教师在教学过程中，应该结合高中生物学知识的讲述，对学生进行这两个观点的教育，要使学生理解现今世界上形形色色的动植物都是逐渐进化来的，一切生物和它们的生活环境都是分不开的，生物必须依赖于它们的环境而生活，而生物的生命活动反过来又时时刻刻在改变着环境，从而对学生进行辩证唯物主义教育。再有，通过讲述祖国丰富的动植物资源，我国古代的和现代的生物科学的成就，对学生进行爱国主义思想教育。
3、重视对学生进行生物学基本技能的训练和能力的培养。
生物学是一门实验科学，实验、观察、标本的采集和制作等在生物教学中有十分重要的地位。这些教学手段对于培养学生学习生物学的兴趣，更好地理解生物学基础知识，掌握实验基本技能，发展他们的智力和培养能力，都有重要的作用。教师一定要积极创造条件，尽可能让学生亲自动手、多实践。教师对教学大纲和教材中规定的学生课外作业也要妥善安排，并指导学生认真完成。通过教学的各个环节和课外活动，努力培养学生的自学生物学知识的能力、观察能力、科学地分析和解释一些生物现象的能力。
4、加强直观教学
直观教学是帮助学生更好地理解教学内容、调动学生学习积极性、巩固记忆的重要方法之一。在实际教学中，我要积极地自制直观教具，密切结合教学内容使用教学挂图、标本、模型、幻灯和教学电影等进行教学。
5、坚持理论密切联系实际
要重视密切联系本地区动植物种类的实际进行教学。教师在教学过程中，应该密切结合本地区的实际情况，选择或者补充讲述当地常见的和对经济发展有重要意义的动植物种类。
6、积极组织和指导生物学课外科技活动。
生物细胞的定义篇4
【关键词】人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP；XIAP相关因子1；细胞凋亡
【中图分类号】R655【文献标识码】A【文章编号】1004-7484（2013）03-0038-02
材料与方法
一、材料
人非小细胞肺癌A549细胞株属我院实验室保存，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所；人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心（北京大学肿瘤临床学院建系，其亲本细胞A549来源于ATCC）；DDP购自山东齐鲁制药有限公司（10mg/支，批号H20023460）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）；特异性引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
二、方法
1细胞培养人非小细胞肺癌A549细胞培养在DMEM（含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）培养液中，人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞培养在含有2mg/LDDP的DMEM培养基中，置37℃、饱和湿度、含5%C02和95%空气的恒温培养箱中培养，隔2-3天换液一次，定期传代，进行试验前1周更换为不含DDP的DMEM培养基以减少DDP对实验的干扰，全部实验均采用指数生长期的A549细胞和A549/DDP细胞。
2MTT法测定A549/DDP细胞的耐药指数取对数生长期的A549和A549/DDP细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度接种于无菌96孔板中，每孔200ul（细胞数约为5×103）。每组设6个复孔。根据预实验结果，A549细胞分别加入DDP终浓度为0?mol/L、1.25?mol/L、2.5?mol/L、5?mol/L、7.5?mol/L、10?mol/L的DMEM培养基，A549/DDP细胞分别加入DDP终浓度为0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、30?mol/L、40?mol/L、50?mol/L的DMEM培养基，继续培养，每24h换液一次，浓度同前，培养至44小时时取出96孔板，根据试剂盒说明书行MTT检测，并计算不同浓度的DDP对A549细胞和A549/DDP细胞的生长抑制率。然后根据SPSS17.0软件得出A549细胞和A549/DDP细胞对DDP的IC50值。耐药指数又称耐药倍数，指耐药细胞对某种药物的半数抑制浓度（IC50）除以敏感细胞的半数抑制浓度，本研究中即耐药细胞A549/DDP对DDP的IC50/敏感细胞A549对DDP的IC50。
3逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测A549和A549/DDP细胞中XAF1、XIAP基因的表达
参照Trizol试剂盒说明书提取两种细胞的总RNA，取终浓度为2.5?mol/L的DDP作用48h之后的A549细胞作为对照组，按RT-PCR试剂盒说明书操作。XAF1引物序列：正义5’-GAGGAGATAAAGCAGCCTATGAC-3’反义5’-CTCTTGCCTGATTGCTGTGG-3’XIAP引物序列：正义5’-TACAGGCATGCTCCACGGTG-3’反义5’-TCCTGCCTCAGTCGCTCTAG-3’β-actin引物序列：正义5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’反义5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’。应用Kodak凝胶数据分析系统对PCR产物电泳带进行扫描拍摄，测定各目的基因和beta-actin扩增产物的光密度值（OD值），利用PCR软件分析，计算目的条带与内参条带的峰面积值比值表示转录水平，进行半定量分析。
三、统计学处理
每组实验最少重复三次.所有数据分析均采用SPSS17.0统计软件包完成。所有计量资料的检测结果以均数±标准差（±s）表示，根据直线回归计算两种细胞对药物的IC50，两个均数比较用ANOVA检验，XAF1mRNA表达两组间的比较采用单因素方差分析，检验水准取P
结果
一、顺铂对A549和A549/DDP细胞增殖的影响（见表1、2），结果表明：顺铂对A549细胞的增殖有明显的抑制作用，且抑制效果呈浓度依赖性，随着顺铂浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549细胞48小时的半数抑制浓度IC50为5.52±0.12?mol/L；顺铂对A549/DDP细胞也有一定的增殖抑制作用，但较A549细胞有明显的耐受，随着药物浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549/DDP细胞48小时的半数抑制浓度IC50为34.96±0.74?mol/L。
A549/DDP细胞对DDP的耐药指数=顺铂对A549/DDP细胞的IC50/顺铂对其亲本敏感细胞株A549细胞的IC50，即34.96?mol/L/5.52?mol/L=6.33。所以A549/DDP细胞确定为耐顺铂的肺癌细胞株，适合进行进一步的肺癌耐药相关机制研究。
表1顺铂对A549细胞的增殖的影响（x±s，n=6）
浓度0?mol/L1.25?mol/L2.5?mol/L5?mol/L7.5?mol/L10?mol/L
OD值1.013±0.0120.901±0.0160.800±0.0250.473±0.0170.302±0.0140.087±0.011
IR（%）011.04±0.0221.01±0.0353.33±0.0270.19±0.0291.41±0.01
表2顺铂对A549/DDP细胞的增殖的影响（x±s，n=6）
浓度0?mol/L10?mol/L20?mol/L30?mol/L40?mol/L50?mol/L
OD值1.041±0.0150.851±0.0080.705±0.0160.582±0.0130.383±0.0170.265±0.016
IR（%）018.25±0.0132.26±0.0244.09±0.0163.20±0.0274.55±0.02
二、RT-PCR检测A549及A549/DDP细胞的XAF1、XIAPmRNA表达情况
RT-PCR结果显示：A549/DDP细胞组较正常A549细胞组XAF1mRNA表达水平下调（P
图1各组细胞中XAF1、XIAPmRNA表达电泳图
A：凋亡细胞（顺铂作用后的A549细胞）B.A549细胞C：A549/DDP细胞
讨论
近年来对肺癌实施的以顺铂（cisplatin，DDP）为主的联合化疗方案的多学科综合治疗，尽管已经取得了一定的疗效，然而，由于铂类耐药的发生，常常导致肺瘤化疗的失败，限制了铂类药物的广泛应用。肿瘤细胞的耐药机制目前尚未完全清楚，一般认为与细胞周期及凋亡异常有一定关系。
随着基因技术的高速发展，肿瘤细胞凋亡研究中的一个重要发现是鉴定了一组与细胞凋亡抑制有关的蛋白家族，即凋亡抑制蛋白家族（IAPs），XIAP相关因子1（XIAP-associatedfactor1，XAF1）是一个应用酵母双杂交法发现的新的XIAP拮抗蛋白，它直接与XIAP结合并抑制XIAP的抗凋亡作用。XAF1基因的失活可能与多种肿瘤的发生、发展关系密切，国内外已对XAF1基因进行了大量临床和基础研究，但在与肺癌耐药的发生发展的关系中该基因深入研究尚未见报道。本研究结果表明，A549/DDP细胞为耐药的细胞株，符合实验条件。耐药的肺腺癌细胞中XAF1基因表达较正常A549细胞减少，较凋亡的细胞减少更加明显，因此不仅说明XAF1基因与细胞的凋亡有关，XAF1蛋白的低表达或表达缺失是肺癌发生的早期分子事件，随着癌细胞分化程度的下降，XAF1蛋白的阳性表达率也逐渐下降，也说明XAF1基因与肺癌细胞的耐药发生有一定的关系，虽然不能证实XAF1基因直接参与了肿瘤细胞耐药的发生，但却表明XAF1表达降低或缺失在肺癌耐药发生、发展中起着重要作用，为研究肺癌耐药的发生、发展提供了新的理论依据，也为逆转肿瘤耐药提供了新的基因靶点。
参考文献：
[1]盛桂凤，毕廷智，刘永萍，等.XRCC1与晚期非小细胞肺癌含铂类药物化疗疗效的关系[J].江苏医药，2013，39（3）：295-297.
[2]郭旭峰，陈勇兵，徐中华，等.凋亡抑制基因XIAP和PED/PEA-15与老年肺癌发生、发展的关系.中国老年学杂志，2008，28（5）：481-483.【摘要】目的：研究肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌中的表达，探讨XAF1在肺腺癌耐药发生、发展中的作用，为基因治疗耐药肺腺癌提供理论依据。方法：本研究培养人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP和其亲本株A549，通过MTT法测定A549/DDP对顺铂的耐药指数；采用半定量逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测两种细胞及凋亡细胞（顺铂作用48h后的A549细胞）中XAF1、XIAPmRNA的表达水平变化。结果：A549和A549/DDP细胞对顺铂的IC50分别为5.52±0.12?mol/L、34.96±0.74?mol/L，因此，A549/DDP对顺铂的耐药指数为34.96/5.52=6.33，确定为耐顺铂的非小细胞肺癌细胞；RT-PCR结果显示A549/DDP细胞较正常A549细胞XAF1mRNA表达水平下调（P
【关键词】人肺腺癌顺铂耐药细胞株A549/DDP；XIAP相关因子1；细胞凋亡
【中图分类号】R655【文献标识码】A【文章编号】1004-7484（2013）03-0038-02
材料与方法
一、材料
人非小细胞肺癌A549细胞株属我院实验室保存，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所；人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心（北京大学肿瘤临床学院建系，其亲本细胞A549来源于ATCC）；DDP购自山东齐鲁制药有限公司（10mg/支，批号H20023460）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；Trizol试剂（Invitrogen公司）；逆转录试剂盒（Fermentas公司）；特异性引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。
二、方法
1细胞培养人非小细胞肺癌A549细胞培养在DMEM（含10%小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）培养液中，人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/DDP细胞培养在含有2mg/LDDP的DMEM培养基中，置37℃、饱和湿度、含5%C02和95%空气的恒温培养箱中培养，隔2-3天换液一次，定期传代，进行试验前1周更换为不含DDP的DMEM培养基以减少DDP对实验的干扰，全部实验均采用指数生长期的A549细胞和A549/DDP细胞。
2MTT法测定A549/DDP细胞的耐药指数取对数生长期的A549和A549/DDP细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度接种于无菌96孔板中，每孔200ul（细胞数约为5×103）。每组设6个复孔。根据预实验结果，A549细胞分别加入DDP终浓度为0?mol/L、1.25?mol/L、2.5?mol/L、5?mol/L、7.5?mol/L、10?mol/L的DMEM培养基，A549/DDP细胞分别加入DDP终浓度为0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、30?mol/L、40?mol/L、50?mol/L的DMEM培养基，继续培养，每24h换液一次，浓度同前，培养至44小时时取出96孔板，根据试剂盒说明书行MTT检测，并计算不同浓度的DDP对A549细胞和A549/DDP细胞的生长抑制率。然后根据SPSS17.0软件得出A549细胞和A549/DDP细胞对DDP的IC50值。耐药指数又称耐药倍数，指耐药细胞对某种药物的半数抑制浓度（IC50）除以敏感细胞的半数抑制浓度，本研究中即耐药细胞A549/DDP对DDP的IC50/敏感细胞A549对DDP的IC50。
3逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测A549和A549/DDP细胞中XAF1、XIAP基因的表达
参照Trizol试剂盒说明书提取两种细胞的总RNA，取终浓度为2.5?mol/L的DDP作用48h之后的A549细胞作为对照组，按RT-PCR试剂盒说明书操作。XAF1引物序列：正义5’-GAGGAGATAAAGCAGCCTATGAC-3’反义5’-CTCTTGCCTGATTGCTGTGG-3’XIAP引物序列：正义5’-TACAGGCATGCTCCACGGTG-3’反义5’-TCCTGCCTCAGTCGCTCTAG-3’β-actin引物序列：正义5’-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3’反义5’-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’。应用Kodak凝胶数据分析系统对PCR产物电泳带进行扫描拍摄，测定各目的基因和beta-actin扩增产物的光密度值（OD值），利用PCR软件分析，计算目的条带与内参条带的峰面积值比值表示转录水平，进行半定量分析。
三、统计学处理
每组实验最少重复三次.所有数据分析均采用SPSS17.0统计软件包完成。所有计量资料的检测结果以均数±标准差（±s）表示，根据直线回归计算两种细胞对药物的IC50，两个均数比较用ANOVA检验，XAF1mRNA表达两组间的比较采用单因素方差分析，检验水准取P
结果
一、顺铂对A549和A549/DDP细胞增殖的影响（见表1、2），结果表明：顺铂对A549细胞的增殖有明显的抑制作用，且抑制效果呈浓度依赖性，随着顺铂浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549细胞48小时的半数抑制浓度IC50为5.52±0.12?mol/L；顺铂对A549/DDP细胞也有一定的增殖抑制作用，但较A549细胞有明显的耐受，随着药物浓度的增加其抑制作用亦随着增强。根据直线同归求出顺铂干预A549/DDP细胞48小时的半数抑制浓度IC50为34.96±0.74?mol/L。
A549/DDP细胞对DDP的耐药指数=顺铂对A549/DDP细胞的IC50/顺铂对其亲本敏感细胞株A549细胞的IC50，即34.96?mol/L/5.52?mol/L=6.33。所以A549/DDP细胞确定为耐顺铂的肺癌细胞株，适合进行进一步的肺癌耐药相关机制研究。
二、RT-PCR检测A549及A549/DDP细胞的XAF1、XIAPmRNA表达情况
RT-PCR结果显示：A549/DDP细胞组较正常A549细胞组XAF1mRNA表达水平下调（P
讨论
近年来对肺癌实施的以顺铂（cisplatin，DDP）为主的联合化疗方案的多学科综合治疗，尽管已经取得了一定的疗效，然而，由于铂类耐药的发生，常常导致肺瘤化疗的失败，限制了铂类药物的广泛应用。肿瘤细胞的耐药机制目前尚未完全清楚，一般认为与细胞周期及凋亡异常有一定关系。
随着基因技术的高速发展，肿瘤细胞凋亡研究中的一个重要发现是鉴定了一组与细胞凋亡抑制有关的蛋白家族，即凋亡抑制蛋白家族（IAPs），XIAP相关因子1（XIAP-associatedfactor1，XAF1）是一个应用酵母双杂交法发现的新的XIAP拮抗蛋白，它直接与XIAP结合并抑制XIAP的抗凋亡作用。XAF1基因的失活可能与多种肿瘤的发生、发展关系密切，国内外已对XAF1基因进行了大量临床和基础研究，但在与肺癌耐药的发生发展的关系中该基因深入研究尚未见报道。本研究结果表明，A549/DDP细胞为耐药的细胞株，符合实验条件。耐药的肺腺癌细胞中XAF1基因表达较正常A549细胞减少，较凋亡的细胞减少更加明显，因此不仅说明XAF1基因与细胞的凋亡有关，XAF1蛋白的低表达或表达缺失是肺癌发生的早期分子事件，随着癌细胞分化程度的下降，XAF1蛋白的阳性表达率也逐渐下降，也说明XAF1基因与肺癌细胞的耐药发生有一定的关系，虽然不能证实XAF1基因直接参与了肿瘤细胞耐药的发生，但却表明XAF1表达降低或缺失在肺癌耐药发生、发展中起着重要作用，为研究肺癌耐药的发生、发展提供了新的理论依据，也为逆转肿瘤耐药提供了新的基因靶点。
参考文献：
生物细胞的定义篇5
inhibitoryeffectofrecombinanttgfalphape40combinedwithsurvivinantisenseoligonucleotidesonbladdertransitionalcellcarcinomacells
yanxiang1,dingqiang2,zhangyuanfang2,xuyonghua3,guohongqian1
1.departmentofurology,affiliateddrumtowerhospital,nanjinguniversity,nanjing210008,china;2.insituteofurology,fudanuniversity;3.labofmolecularandcellularoncologyandlabofmolecularcellbiology,instituteofbiochemistyandcellbiology,shanghaiinstitutesforbiologicalsciences,chineseacademyofsciencesabstract：objectivetoinvestigatewhetherthesurvivinantisenseoligonucleotidescoulddecreasetheexpressionofsurvivininvitroandsensitizehumanbladdertransitionalcellcarcinomat24cellstorecombinanttgfalphape40(tp40).methodstheexperimentcellsweredividedintofivegroup,suchascontrolgroup,survivinmissenseoligonucleotidesgroup(ms),survivinantisenseoligonucleotidesgroup(as),tp40groupandcombinedgroup(tp40+as).rtpcrandwesternblotassaywasperformedtodetecttheexpressionofsurvivininallgroupscells.mttassaywasappliedtodetectthecellproliferationofallgroups.flowcytometrywereperformedtodetecttp40triggeredapoptosis.thetumorformationexperimentoft24cellsinvitrowasusedtoevaluateallgroupscells'independentabilityofanchoringgrowth.resultsthesurvivinantisenseoligonucleotidescoulddownregulatetheexpressionofsurvivinataconcentrationof300nm.wehavedemonstratedfromthemrnalevelandproteinlevelthatthecombinedgroupcoulddownregulatetheexpressionofsurvivincomparedwiththenoncombinedgrouppowerfully.inthethirdday,thesurvivalrateofthecombinedgroupcellswasonly12.2%,theapoptoticratewas96.37%,andtheabilityoftumorformationinvitrowasverypoor.conclusionsurvivinantisenseolignucleotidescouldsensitizehumanbladdertransitionalcellcarcinomat24cellstotp40withacooperativeeffect.
keywords：transforminggrowthfactoralpha;antisenseoligonucleotides;bladderneoplasms;therapy
膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一。有10％～15％的非浸润性膀胱癌最终发展成浸润性膀胱癌或者发生转移[1]。近年来，生物治疗为晚期膀胱癌的治疗提供了一条新的途径。先前已有研究表明重组转化生长因子α绿脓杆菌外毒素融合蛋白（tgfαpe40，简称tp40）对人膀胱癌细胞的生长具有抑制作用[1]。本研究旨在探讨联合survivin反义寡核苷酸和tp40对人膀胱癌细胞增殖的作用。
1材料与方法
1.1主要材料
人膀胱癌t24细胞（简称t24细胞）和基因重组tp40由中国科学院上海细胞生物学研究所合成并提供。全程硫代修饰的survivin反义寡核苷酸（as）、错义寡核苷酸（ms）和rtpcr所用引物均由赛百胜公司合成。as序列5′cccagccttccagctccttg3’[2]，ms序列5′cccacccttgcacctccttg3′。
1.2方法
1.2.1细胞培养t24细胞培养在dmem（美国gibco公司）中，包含15％小牛血清（杭州四季青公司），100ku/l的青霉素和链霉素，并置于含5％co2的37℃培养箱中培养。
1.2.2细胞转染将t24细胞在lipofectin（gibico/brl公司）介导下进行反义寡核苷酸的转染，操作按试剂盒说明进行。转染6h后用含15％小牛血清的dmem培养液终止反应。对照组采用含相同浓度lipofectin的无血清dmem培养液。
1.2.3rna提取及rtpcr
采用trizol一步法提取总rna。取2μl总rna，70℃孵育10min。cdna合成（反应体系20μl）：mgcl2（25mm）4μl、rtbuffer（×10）2μl、dntps（10mm）2μl、rna酶抑制剂（20u/μl）0.5μl、随机引物(50mm)1.0μl、amv逆转录酶（25u/μl）0.8μl。逆转录条件为：25℃孵育10min，42℃孵育45min，最后95℃孵育5min。
pcr扩增（反应体系25μl）：取2μl逆转录产物，加pcrbuffer（×10）2.5μl、mgcl2（25mm）1.5μl、dntps（10mm）0.5μl、正义引物(25mm)0.5μl、反义引物(25mm)0.5μl、taqdna聚合酶（5u/μl）0.5μl。设计survivin正义引物5′atgggtgccccgacg3′，反义引物5′atccatggcagccagct3′（基因库查找号nm_001168）。反应液先进行95℃初变性2min，再进行30个循环（survivin）的pcr扩增，最后72℃延伸10min。循环参数：94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s。所有标本同时行gapdh25个循环的pcr扩增，以此作为内对照来衡量各标本rna的质与量。pcr产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外线下成像。
1.2.4westernblot检测收集t24细胞，裂解后煮沸、离心。蛋白质样品经6％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜上，分别用鼠抗人survivin（6e4）单克隆抗体(1∶2000)孵育。然后用辣根过氧化酶偶联的抗兔或抗鼠抗体（1∶5000）孵育。最后用增强的化学发光试剂检测。
1.2.5流式细胞检测收集用不同浓度的tp40处理的细胞，pbs洗涤两次后用70％乙醇4℃固定过夜。用pbs洗两次，再用800μl的propidiumiodide和200μl的无dnase的rnasea染色。propidiumiodide染上的细胞核的荧光强度由流式细胞仪来测定。
1.2.6mtt法检测活细胞细胞按3×103个/孔的密度接种于96孔板，24h后，各组分别加入100μl无血清dmem配制的干预溶液处理1、2、3天，其中tp40处理浓度为750ng/ml[1]，寡核苷酸处理浓度为300nm，并用未处理的细胞作为空白对照（仅含lipofectin的无血清dmem培养液）。转染6h后更换含15%小牛血清的dmem培养液，同时补充相应的tp40。检测时，每孔加入25μlmtt（5g/l），37℃孵育2h，每孔加入100μlextractionbuffer，37℃温育过夜，最后用96空板酶标仪测其于570nm的光吸收值(a)[3]。细胞存活率由下算式计算：a实验组/a对照组×100％。
1.2.7体外软琼脂糖成瘤实验取对数生长期的各组细胞，用0.25％胰酶消化成单个细胞后，按2×103/1.5ml的密度重悬于0.35％软琼脂糖的dmem（含10％胎牛血清）溶液，再加入已铺入底层胶的6孔板中。经过20天培养后，每孔加入1ml的0.5mg/mlpiodonitrotetrazoliumvillet（sigma）孵育过夜，凉干拍照。
1.3统计学方法
采用sasversion8.2统计软件进行方差分析。p＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1survivin反义寡核苷酸对t24细胞的作用
以不同浓度的survivin反义寡核苷酸处理t24细胞48h，发现survivin反义寡核苷酸随浓度的增加对survivinmrna的表达有明显抑制作用，但在浓度达到300nm以上时，其抑制作用不再明显增加。因此在下面的实验中survivin反义寡核苷酸的处理浓度均采用300nm。
2.2联合suivivin反义寡核苷酸和tp40对t24细胞的作用
2.2.1rtpcr结果survivin的电泳条带大小为426bp，gapdh条带大小为452bp。如图1所示，以gapdh作为内对照，可见as组和tp40组t24细胞survivin片段表达较ms组和空白对照组明显减弱，联合组（as＋tp40）t24细胞survivin的表达量更加降低。而ms组和空白对照组之间无明显差别。
2.2.2westernblot检测结果survivin阳性表现为分子量为16kd的条带。如图1所示，以βactin作为内对照，可见as组和tp40组t24细胞survivin表达较ms组和空白对照组明显减弱，联合组（as＋tp40）t24细胞survivin表达更加降低。而ms组和空白对照组之间无明显差别。
2.3t24细胞增殖的生物学特性
2.3.1mtt检测各组细胞的生长情况见图2，可见as和tp40均可以明显抑制t24细胞生长，但两者联合用药后（as＋tp40）的生长抑制作用更加明显（p＜0.0001），ms组较对照组无显著性差异（p＞0.05），as组较tp40组无显著性差异（p＞0.05）。联合组（as＋tp40）第1、2、3天的细胞存活率分别为65.6%、42.1%和12.2%。
2.3.2流式细胞仪检测图3为各组细胞的凋亡情况。可见ms组仅有9.55％细胞凋亡，和对照组的9.52％无明显差别。as组、tp40组分别有36.96％、57.15％的细胞出现凋亡，而联合组（tp40＋as）的细胞凋亡为96.37％，较单独用药组的作用更加明显。
2.3.3体外软琼脂糖成瘤试验我们检测了各组细胞的体外锚定非依赖性生长的能力。如图4，在软琼脂中，对照组和ms组的t24细胞显示了强大的生长能力，形成了大量克隆。与此相反，tp40组和as组的体外锚定非依赖性生长的能力则大大降低，联合组（tp40+as）细胞几乎没有形成克隆。在3次的独立重复实验中，此结果都得到了很好的重复。
3讨论
近年来我国膀胱癌的发病率明显上升。膀胱癌多数以浸润方式生长，复发非常普遍，虽然可以用局部治疗来控制，但仍有10%～15%的非浸润性膀胱癌最终发展成浸润性膀胱癌或者发生转移。晚期膀胱癌患者更是缺乏有效的治疗方法。临床治疗效果证明化疗和放疗对预防膀胱肿瘤复发，以及治疗晚期膀胱肿瘤的疗效有限。大量的研究表明基因治疗和生物治疗是控制晚期肿瘤最有希望的手段，并可能用于预防肿瘤复发。在生物治疗和基因治疗的研究中，杀伤强度、作用靶向性和可控性一直是世界各国研究者所追求的目标。在短期内实现作用完全可控性难度极大，目前研究的热点多数集中在作用靶向性和提高作用强度上。本研究探讨了生物治疗和抗凋亡手段对膀胱肿瘤细胞的杀伤作用。
肿瘤egfr阳性表达被认为是不良分化的重要标志，高水平表达的egfr可以成为抑制膀胱肿瘤生长的导向攻击目标[4]。大量的研究表明人膀胱癌能高水平地表达egfr[5]。利用基因工程手段将tgfαcdna顺序与pe40（绿脓杆菌外毒素）片断cdna顺序连接，表达出有生物活性的tgfαpe40融合蛋白（简称tp40）。该蛋白具有与表达egfr的靶细胞特异结合的能力，因而起着导向的作用，同时携带pe40进入细胞，高效地阻断靶细胞内蛋白质合成，导致细胞死亡。先前的研究表明，tp40对膀胱癌t24细胞的生长有较强抑制作用，能够明显抑制t24细胞dna的合成，并诱导肿瘤细胞凋亡，而且这种作用具有导向性，对egfr大量表达的肿瘤细胞具有明显杀伤作用[1]。
近年来发现抗凋亡因子survivin可能参与了肿瘤的发生机制[6]，采取措施下调survivin表达可达到抑制肿瘤生长的作用[79]。研究表明在膀胱癌survivin表达明显增高，而且survivin在正常组织不表达[10]。进一步研究发现tp40可以在一定程度上下调survivin的表达，说明survivin可能参与了tp40的作用机制。本研究针对survivin合成了反义寡核苷酸，将两者联合应用发现，采用反义寡核苷酸封闭survivin的表达可以增强tp40对膀胱癌t24细胞的生长抑制作用。流式细胞仪检测证明了联合作用可以明显诱导凋亡，体外软琼脂糖成瘤实验也显示出联合作用的细胞锚定非依赖性生长能力极差。这样反过来更加证明了下调survivin表达是tp40的作用机制之一，同时也找到了一种更强有效的导向性治疗膀胱肿瘤的新办法，即联合应用tp40和survivin反义寡核苷酸治疗膀胱肿瘤。
本研究为进一步的动物实验研究和临床研究奠定了基础，为临床膀胱癌的生物治疗研究开辟了一个新的领域。
【参考文献】
［1］燕翔,丁强,张元芳，等.基因重组转化生长因子α绿脓杆菌外毒素融合蛋白对人膀胱癌t24细胞生长的抑制作用［j］.中华外科杂志,2004，42（23）：14571459.
［2］oliera,simoeswustap,baumannb,etal.anovelantisenseoligonucleotidetargetingsurvivinexpressioninducesapoptosisandsensitizeslungcancercellstochemotherapy［j］.cancerres,2000,60(11):11171123.
［3］carmichaelj,degraffwg,gazdaraf,etal.evaluationofatetrazoliumbasedsemiautomatedcolorimetricassay:assessmentofchemosensitivitytesting［j］.cancerres,1987,47(4):936942.
［4］徐永华.细胞生长因子和受体［j］.生命的化学,1992,12（4）：47.
［5］丁强,张元芳,孙逊，等.膀胱癌组织中egfr和p21蛋白的表达评价［j］.实用癌症杂志,1996,11（2）:7678.
生物细胞的定义篇6
一、难点解析
1．细胞质遗传并非都是母系遗传
细胞质遗传现象的发现最早可追溯到1909年，德国学者科伦斯（CarlCorrens）和鲍尔（Baur）分别在紫茉莉和天竺葵中发现叶色的遗传不符合孟德尔定律，而表现为细胞质遗传现象。后来的研究表明，大多数物种的细胞质性状表现为母系遗传的特征，因而有些学者甚至某些遗传学教科书中也将细胞质遗传与母系遗传这两种现象混为一谈，将这两个概念等同起来，并认为细胞质遗传即为母系遗传。
20世纪80年代以来，随着分子生物学技术的发展，将DNA分子标记应用于细胞质遗传研究，从DNA分子水平上研究细胞质遗传物质的变异，使得人们对细胞质遗传现象有了更进一步的认识。据研究表明，在所有高等真核生物中，线粒体DNA一般表现为母系遗传的特征，包括人类、其他哺乳类动物、两栖动物、鱼类及高等植物等。但也发现，老鼠、衣藻、被子植物月见草属的一个杂种、大麦和黑麦的属间杂种、甘蓝型油菜、北美红杉等生物体中线粒体DNA是父系遗传的。在被子植物中，对近60个物种的质体DNA的遗传研究，发现大多数表现为母系遗传特征，而其中20％的物种中存在着双亲遗传的现象，紫花苜蓿、胡萝卜等植物表现为典型的父系遗传特征。与被子植物相比，大多数裸子植物的质体DNA则表现为父系遗传特征。
可见，细胞质遗传表现为多种形式的复杂性，没有一种简单的机制去解释这种现象。母系遗传是细胞质遗传的主要特征，而不能代表细胞质遗传的全部内容。随着分子生物学技术的发展和应用，为人们对细胞质遗传规律的研究和认识提供了强有力的手段，科学家们已揭示出了生物细胞质DNA遗传的新规律和新现象，在细胞质遗传方面表现为单亲的母系遗传、父系遗传及双亲遗传多种形式，大大丰富和逐步完善了细胞质遗传研究的内容。[1]
2．下定义不同于作诠释
下定义和作诠释是在编写教材时经常用到的、极易混淆的两种逻辑学概念。所谓下定义，就是用准确、简练、概括的语言说明事物本质的一种说明方法。[2]例如“基因是有遗传效应的DN段”就运用了下定义的说明方法。其中，定义项“有遗传效应的DN段”是对被定义项“基因”的本质特征的揭示。而作诠释，则是对事物或事理的某些性质和特点进行适当解释的一种说明方法。有些被说明的事物经过下定义，读者理解起来感到困难，甚至产生误解，这就需要采用作诠释的方法。例如对“细胞分化”这一概念，教材是这样表述的：“在个体发育中，由一个或一种细胞增殖产生的后代，在形态、结构和生理功能上发生稳定性差异的过程，叫做细胞分化。细胞分化是一种持久性的变化，细胞分化是生物界中普遍存在的生命现象，是生物个体发育的基础。”在这段话中，首先用了下定义的方法概括了细胞分化的本质，然后用作诠释的方法对细胞分化做了进一步的说明。
下定义与作诠释的区别是多方面的：下定义要揭示事物的本质特征，并且定义项的外延与被定义项的外延必须是全同的[3]；而作诠释并不要求从本质上去揭示概念，只要揭示概念的一部分内涵就可以了，并且解释的对象与做出的解释外延也可以不相等。例如“细胞质遗传”这节内容，教材在介绍了紫茉莉花斑植株的杂交结果后，这样表述细胞质遗传的特点，“从上述杂交实验的结果可以看出，紫茉莉F1植株的颜色，完全取决于种子产生于哪一种枝条，而与花粉来自哪一种枝条无关。也就是说，F1的性状，完全是由母本决定的。像这样具有相对性状的亲本杂交，F1总是表现出母本性状的遗传现象，叫做母系遗传”。教材中这句话是采用了下定义还是作诠释的说明方法呢？若是下定义，那么根据下定义说明方法的特点，定义项和被定义项的外延必须是全同的，即F1总是表现出母本性状的遗传现象就一定是母系遗传；反过来，母系遗传的F1也总是表现出母本性状。事实是否如此呢？我们知道，椎实螺外壳的遗传，其子一代F1外壳的旋转方向总是与母本的表型相同，这是由核基因的产物积累在卵细胞中所决定的，生物学上称之为母性影响，而不是母系遗传。再如，本节内容中紫茉莉花斑植株的花做母本，其F1除了花斑植株，还出现了绿色和白色两种不同于母本的植株。可见，F1总是表现出母本性状的遗传现象，并不一定是母系遗传，而母系遗传的F1也不一定仅表现出母本性状。因此，教材中的表述不是给母系遗传下定义，而是以作诠释的方式介绍了母系遗传的现象。
可见，学生把教材中对母系遗传的诠释当做严格的下定义，从而得出“‘母系遗传’与‘F1总是表现出母本性状’的外延有全同关系，因此具有母系遗传特征的紫茉莉花斑枝条上的花做母本，F1必定是与母本一样的花斑植株”等一系列逻辑推理，直至与F1产生三种植株的事实相矛盾，从而断定“F1总是表现出母本性状”的表述错误。殊不知，他们在推理的源头就错了。
综上所述，混淆了细胞质遗传与母系遗传以及误解了教材中关于母系遗传现象的表述导致本节内容难点的产生。
二、难点突破
1．引发认知冲突
任何学科体系的构建都离不开众多学科概念，概念混淆和错位是概念学习中常见的错误。如何使学生从错误概念向正确概念转变，是科学教育界研究的热点问题。对于有些同学认定细胞质遗传就是母系遗传以及F1总是表现出母本性状的遗传就是母系遗传的错误理解，教师不必急于纠正，可以提供一些与他们的理解相矛盾的事实，如Erickson和Kemble在双子叶的甘蓝型油菜中发现了线粒体DNA父系遗传，Ohba等观察到日本柳杉中质体DNA表现为双亲遗传，椎实螺子一代F1外壳的旋转方向总是与母本的表型相同，但不是母系遗传等，引导学生认识到先前理解的错误，从而转向正确理解细胞质遗传的本质及与母系遗传的关系。
2．绘制概念图表
为了能更直观地把握细胞质遗传、母系遗传和F1的表型之间的关系，还可以通过绘制概念图来解决这一问题。所谓概念图，实质上就是用于组织和表征知识信息的工具，它通常是将有关某一主题不同级别的概念或命题置于方框或圆圈中，再以各种连线将相关的概念和命题连接，这就形成了关于该主题的概念图。
对于细胞质遗传与母系遗传、母系遗传与F1的关系，教学中首先指出细胞质遗传的本质是生物性状通过细胞质内的遗传物质控制的遗传方式，主要表现为母系遗传，但也有少数表现为父系遗传和双亲遗传（如图1），F1与母本性状一致并不一定是母系遗传（如图2），然后以概念图的方式展示这些概念之间的关系，则细胞质遗传、母系遗传和F1的表型三者之间的关系就一目了然了。
以上是笔者对本节内容难点形成的看法及采取的对策。当然，本节内容的教学难点与重点并不完全一致，在教学中不能花费太多时间，因此探讨巧妙突破难点、进行有效教学的策略仍是摆在我们教学工作者面前的重要课题。
（作者单位：占芳龙，都昌三汊港中学，江西都昌，332600；吴笑臣，赣南师范学院化生学院，江西赣南，341000）
参考文献：
［1］田志宏．细胞质遗传并非都是母系遗传［J］．生物学通报，1999（1）：14-15.
