细胞生物学定义(6篇)

细胞生物学定义篇1

目的：观察高糖条件下VEGFmRNA,EPOmRNA和EPORmRNA在体外培养的Müller细胞中的表达情况。方法:胰蛋白酶将新生小鼠视网膜组织吹打消化后，制成单细胞悬液，体外培养Müller细胞，RT?PCR测定高糖条件下视网膜Müller细胞VEGF,EPO和EPOR基因的表达。结果：成功获得视网膜Müller细胞,传代后90%以上的细胞呈兔抗鼠谷氨酰胺合酶（GS）染色阳性。Müller细胞VEGFmRNA，EPOmRNA和EPORmRNA在高糖条件下表达升高，且呈浓度依赖性(P<0.05)，但糖浓度50mmol/L组较40mmol/L组差异无统计学意义，无明显时间依赖性。结论：Müller细胞在高糖条件下VEGF，EPO，EPOR的表达增加。教师职称

【关键词】视网膜Müller细胞；血管内皮生长因子；促红细胞生成素；促红细胞生成素受体；新生血管

AbstractAIM:Toobservetheexpressionsofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF),erythropoietin(EPO),erythropoietinreceptor(EPOR)mRNAindifferentlevelsofglucoseintheretinalMüllercellsofmiceinvitro.METHODS:Müllercellsofnew?bornmicewereculturedwithenzymedigestion.Müllercellswereseparatedandpurifiedbyblowingandstrikingmethod.TheexpressionsofVEGFmRNA,EPOmRNA,andEPORmRNAweredetectedbyRT?PCR.RESULTS:RetinalMüllercellswereculturedsuccessfully,90%ofwhichwerepositivelystainedbyglutaminesynthetase(GS).TheexpressionsofVEGFmRNA,EPOmRNAandEPORmRNAinretinalMüllercellsweresignificantlyenhancedinthehighglucosegroupwhichincreasedobviously(P<0.05),butthedifferencebetween50mmol/Lgroupandthe40mmol/Lgroupdidnothavestatisticalsignificanceortimedependence.CONCLUSION:Withglucoseconcentrationelevating,VEGF,EPO,EPORexpressionofculturedretinalMüllercellsincreased.

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KEYWORDS:retinalMüllercells;vascularendothelialgrowthfactor;erythropoietin;erythropoietinreceptor;neovascularization

0引言

糖尿病视网膜病变(diabeticretinopathy,DR)是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一,是患者视力丧失的主要原因。视网膜Müller细胞为一种特殊的神经胶质细胞，在病理因素下，参与DR的发生。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)和促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)具有血管生成素的活性[1]。已经发现，VEGF主要由视网膜Müller细胞分泌，近来Fu等[2]发现，正常视网膜组织中的EPO主要是由Müller细胞产生的。而增生性视网膜病变(proliferativediabeticretinopathy,PDR)患者的眼玻璃体中的EPO浓度增高，与血清中EPO浓度无关[3]。那么，视网膜Müller细胞中VEGF，EPO和促红细胞生成素受体(erythropoietinreceptor，EPOR)的表达受哪些因素调控呢？是否与细胞周围环境中糖浓度有关呢？同时，还是否与葡萄糖作用时间有关呢？为了证实以上假设，我们采用不同葡萄糖浓度干预鼠视网膜Müller细胞，并且同一糖浓度组干预不同的时间，然后观察Müller细胞VEGF，EPO和EPOR基因表达的变化，从而探讨高糖对视网膜Müller细胞VEGF，EPO和EPOR基因表达的调控作用。

1材料和方法教师职称

1.1材料

出生7d的清洁级健康昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。逆转录试剂盒（Promeg公司），SimplyP总RNA提取试剂盒（Solarbio公司），兔抗鼠谷氨酰胺合酶（GS）（美国Adi公司），高糖型和低糖型DMEM培养液（美国Hyclone公司），胎牛血清（FBS）（灏洋生物技术公司），PCR试剂盒（大连宝生物有限公司），PCR引物及DNA分子量标准(上海生物工程有限公司)，DAB显色盒、生物素标记的山羊抗兔IgG、辣根酶标记的链霉卵蛋白素工作液（北京中衫金桥生物技术有限公司）等。出生7d的昆明小鼠脱颈处死后，无菌条件下迅速摘除眼球，移入超净台，D?Hanks液重复冲洗2次后，将离体眼球置于含DMEM培养液(含200mL/L胎牛血清、100kU/L青霉素、100mg/L庆大霉素)沿角膜缘后约1mm剪开，轻轻挤压剥取视网膜。将视网膜剪碎，2.5g/L胰蛋白酶消化10min，含血清培养液终止消化。反复吹打细胞制成细胞悬液，经200目筛网过滤后，800r/min离心5min后弃上清。DMEM培养液调整细胞浓度为3×108/L，接种于事先包被有明胶的50mL塑料培养瓶内,置入恒温湿热培养箱(37℃，含50mL/LCO2，50mL/L空气)中培养。3～4d后，首次半定量换液，以后换液2～3次/wk。约10～12d，达80%以上融合，以1∶2方式进行传代。小鼠视网膜细胞悬液接种于细胞培养瓶24h后，可见有细胞贴壁呈不规则圆形，有角。3～5d后贴壁细胞增多，并从边缘长出数个细胞伪足。而后细胞分裂生长，10～12d左右融合达80%以上时，细胞形态典型：胞体呈长梭形，胞质丰富，胞核位于胞体中央、椭圆形、有2个或2个以上核仁，细胞呈轴向平行而紧密排列，可进行消化传代培养。P1～P4代细胞5～7d左右融合达80%以上，与原代细胞具有相似的细胞形态，胞体较原代细胞变大，变长，呈梭形、星形等多种形态。细胞间可有嵌合、粘连。取第2～3代细胞消化接种于预置有盖玻片的六孔培养板内，待盖玻片上细胞增殖到80%融合时，以谷氨酰胺合酶(GS)为一抗，进行免疫细胞化学染色,阴性对照用PBS代替一抗，DAB显色剂显色，苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并照相。免疫细胞化学染色示细胞质中和细胞膜上出现棕黄色、棕褐色颗粒状或者网状物质的为阳性细胞。阳性细胞率>90%，可以认为实验所用为Müller细胞。而加PBS代替一抗的细胞，免疫细胞化学染色呈阴性。

1.2方法教师职称

以P3代对数生长期的小鼠视网膜Müller细胞用于实验：将P2代Müller细胞种植于六孔板中，种植前用含200mL/L胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液并计数调整细胞浓度约为3×108个/L，接种至六孔培养板中，每个孔1mL，置于恒温湿热培养箱中培养。当孔中细胞达到80%融合时，换无血清培养液培育24h。分为对照组(糖浓度为25mmol/L)和高糖组(糖浓度分别为30，40和50mmol/L)，培养1，3和5d。干预过程中每天换液，维持恒定干预浓度。每孔做3个。用SimplyP总RNA提取试剂盒（Solarbio公司），提取细胞的总RNA，取RNA5μL以15g/L琼脂糖凝胶电泳分析总RNA的完整性，在紫外灯下见到明显的5S，18S，28S的条带认为合格；RNA2μL用紫外分光光度计测A260nm和A280nm计算A值和浓度，两者比值在1.8～2.0之间者视为合格，剩余于?70℃保存。小鼠引物序列采用Primer5.0引物设计软件设计，所有碱基对均经BLAST程序检验。所有引物系列均由上海生工生物工程公司合成。EPO引物序列：上游5?CTCTGGGCCTCCCAGTC3?、下游：5?TGTTCGGAGTGGAGCAG3?，PCR产物大小410bp。EPOR引物序列：上游5?ATTGGATAAGTGGTTGCTGCC3?、下游：5?CCCCCGAACTGTAATCTGTTG3?，PCR产物大小305bp。VEGF引物序列：上游：5?GGATCCATGAACTTTCTGCT3?、下游：5?GAATCCACCGCCTCGGCTTGTC3?，PCR产物大小450bp。β?actin引物序列：上游：5?GTGGGCCGCTCTAGGCACCA3?、下游：5?CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGG3?,PCR产物大小245bp。按照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit说明进行，总反应体系为20μL，反应前将RNA终浓度调整为0.1g/L，进行逆转录反应。各取cDNA2μL，分别加入VEGF，EPO和EPOR特异性引物，引物终浓度调整为20μmol/L；内参照β?actin特异性引物终浓度调整10μmol/L。按Taq酶说明书加入试剂，PCR扩增条件：94℃，30s，变性；VEGF60℃，1min，退火，EPO59℃，1min，退火，EPOR58℃，1min，退火；68℃，2min，延伸。以上3步循环35次，最后72℃，终末延伸10min。扩增反应结束后取PCR产物5μL与LoadingBuffer1μL混合，进行15g/L的琼脂糖凝胶电泳，100V，30min后，自动凝胶成像仪成像分析，计算目的基因mRNA的相对含量。mRNA的相对含量=目的基因mRNAA值/β?actinmRNAA值。应用MBI公司100bp梯度maker为分子大小对照确定电泳条带。

统计学分析：实验数据用SPSS17.0软件处理，结果用均数±标准差(±s)表示VEGF，EPO和EPOR的表达组间均数比较采用独立样本t检验，P<0.05为有统计学意义。

2结果

2.1VEGFmRNA的表达教师职称

Müller细胞VEGFmRNA的表达基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(P<0.05)，但葡萄糖浓度50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。随着干预时间的延长Müller细胞表达VEGFmRNA的表达差异无统计学意义(图1，表1)。表1Müller细胞VEGF,EPO,EPORmRNA的表达(略)

2.2EPOmRNA的表达

视网膜Müller细胞EPOmRNA的表达基本上呈浓度依赖性(P<0.05)，但至最高浓度时(即培养液葡萄糖浓度50mmol/L)差异无统计学意义。在相同糖浓度作用条件下EPOmRNA表达的差异无统计学意义(图1和表1)。

2.3EPORmRNA的表达

Müller细胞EPORmRNA的表达基本上随着葡萄糖浓度的增加逐渐增强(P<0.05)，50mmol/L浓度组相较40mmol/L浓度组差异无统计学意义；相同糖浓度条件下EPORmRNA的表达随时间的变化，差异无统计学意义(图1和表1)。

3讨论

视网膜Müller细胞是一种特化的视网膜神经胶质细胞，具有维持视网膜正常结构与功能、营养视网膜等多种生理功能。DR血管闭塞区域Müller细胞胶质反应性增强，细胞轴突长入闭塞的毛细血管内腔，可能参与PVR和PDR相关的牵拉性视网膜脱离[4]。Müller细胞对胶质细胞酸性蛋白、波纹蛋白、谷氨酸胺合酶（GS）、S抗原、碳酸酐酶等染色阳性，因只有GS在视网膜中仅存在于Müller细胞，所以GS为Müller细胞的特异性标志物[5]。体外培养时25～30mmol/L的高糖浓度，可近似地等同于糖尿病时体内高糖状态，故以此为对照组。我们实验选用30，40和50mmol/L的葡萄糖浓度模拟体内的绝对高糖环境。实验中采用了高糖DMEM培养液，取25mmol/L葡萄糖浓度作为对照组。VEGF是由2条相同多肽链组成的高度糖基化碱性蛋白。免疫组化研究表明，糖尿病患者视网膜血管内皮细胞VEGF反应明显增高，而非糖尿病患者视网膜毛细管内皮细胞及周细胞染色较弱[6]。高糖作为DR的始动因素，其可能机制之一为诱导视网膜Müller细胞VEGF的表达，并且已经出现了针对VEGF血管生成素活性的治疗手段。Avastin是重组的人类单克隆IgG1抗体，与VEGF异构体结合，达到中和配体的作用，从而抑制其生物活性。在PDR手术前1～2wk玻璃体腔注射1～1.25mg的Avastin可以有效地减少术中出血，并且使新生血管消退[7]。我们发现，不同浓度葡萄糖组的Müller细胞VEGF表达较前一浓度升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，这与以往的报道是一致的。而50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。这种现象可能是Müller细胞的一种自分泌反馈调节机制。而随着干预时间的延长，Müller细胞VEGF的表达差异无统计学意义。教师职称

EPO是含有165个氨基酸，分子质量为34.4kDa的激素糖蛋白，EPOR属于Ⅰ型细胞因子受体家族成员之一，由507个氨基酸组成。研究表明在增生性糖尿病视网膜病(PDR)患者的眼玻璃体中的EPO浓度较普通人有显著的提高[8]。高氧诱导的血管增生性视网膜病变的动物模型实验，玻璃体内注射促红细胞生成素受体抗体（EPORA），发现突破视网膜内界膜进入玻璃体腔内的新生血管内皮细胞核明显少于未经注射眼，且新生血管的密度明显轻于未注射眼[9]。EPO/EPOR系统与糖尿病视网膜病变的联系可以具体到DR的不同阶段。早期糖尿病大鼠的视网膜中EPOR呈大量强阳性表达，到了DM的晚期EPO便作为一个血管源性因子发挥作用[10]，由此推测在早期DR中EPO/EPOR是自我保护系统，到了晚期EPO的自我保护转化成了致病因素。我们的实验中发现：不同浓度葡萄糖组的Müller细胞EPOmRNA，EPORmRNA表达较前一浓度组明显升高(P<0.05)。而50mmol/L组相较40mmol/L组差异无统计学意义。同样可能为Müller细胞的自分泌反馈调节。随着干预时间的延长，Müller细胞EPO/EPOR的表达差异无统计学意义。故高糖条件下视网膜Müller细胞的EPO/EPOR表达增多可能为DR发生的机制之一。因此，我们推测DM可能通过刺激视网膜Müller细胞VEFG,EPO,EPOR的分泌增多，从而导致DR的发生。

【参考文献】

1俞梅，郎景和，朱兰，等.子宫颈病变中促红细胞生成素受体的表达及其与微血管密度的相关性研究.中国现代实用医学杂志2005；14（6）：1?4

2FuQL,WuWT,WangH,etal.Upregulatedendogenouserythropoietin/erythropoietinreceptorsystemandexogenouserythropoietinrescueretinalganglioncellsafterchronicocularhypertension.CellMolNeurobiol2008；28(2):317?329

3KatsuraY,OkanoT,MatsunoK,etal.Erythropoietinishighlyelevatedinvitreousfluidofpatientswithproliferativediabeticretinopathy.DiabeteCare2005；28（9）：2252?2254

4凌志红,徐格致.糖尿病视网膜Müller细胞病理改变的体内外研究.眼科研究2005；23(3):262?265

5苟琳,张作明,徐汉鹏.视网膜Müller细胞在视网膜病变中的作用和研究现状.眼科研究2003；21（2）：217?220

教师职称

6YokoiM,YamagishiSI,TakeuchiM,etal.ElevationofAGEandvasularendothelialgrowthfactorwithdecreasedtotalantioxidantstatusinthevitreousfluidofdiabeticpatientswithretinopathy.BrJOphthalmol2005；89(6):673?675

7李灵,席新华.Avastin在眼科中的应用.国际眼科杂志2008；8(3):582?583

8LynchSS,ChengCM.Bevacizumabforneovascularoculardiseases.AnnPharmac2007；41(4):614?625

细胞生物学定义篇2

关键词：重症急性胰腺炎，谷氨酰胺，肠道免疫

基金项目：2014福建省科技项目计划，编号：2014D030

谷氨酰胺（Gln）是人体最多的游离氨基酸之一，在生理情况下是非必需氨基酸。在某些危重疾病，如急性胰腺炎时，由于消耗明显增多等原因导致Gln明显缺乏。补充谷氨酰胺可以治疗重症急性胰腺炎，但具体机制尚未完全明了，本文拟通过动物试验研究丙氨酰-谷氨酰胺对重症急性胰腺炎大鼠肠道免疫功能的影响，探讨其可能的作用机制。

1.资料与方法

1.1实验动物采用福建医科大学实验动物中心的清洁级SD大鼠，体重180-240g，经适应性喂养24h后用于实验。

1.2实验动物分组购买来的SD大鼠，适应性喂养24h，随机分为SAP组（60只）和对照组（20只）。SAP组又随机EN组、EN+Gln组和PN组、PN+Gln4组。

1.3动物模型的制备通过逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠溶液建立大鼠重症急性胰腺炎模型，采用传统的Aho【1】逆行胰胆管注射法建立大鼠SAP模型。SAP大鼠术中将3.5%牛磺胆酸钠溶液用微量注射泵恒速注入胰胆管内，用量1ml/kg体重，以0.2ml/min的速度注射完毕;对照组大鼠术中使用生理盐水进行胰胆管灌注，剂量及方法同SAP组。EN组采取胃十二指肠置管方法进行肠内营养，PN组采取尾静脉留置插管方法进行肠外营养。对照组进行假手术后给予自由普通饮食。

1.4营养制剂EN营养制剂组分为：水、麦芽糊精、酪蛋白、植物油、膳食纤维（大豆多糖等）、矿物质、维生素和微量元素等。每100ml提供总能量10Okal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为61：20：19。PN营养制剂：采用50%葡萄糖、20%复方氨基酸和20%脂肪乳剂作为基本营养成分，每100ml提供总能量100kal，碳水化合物、蛋白质、脂肪供能比为56：19：25。Gln制剂：EN+Gln组及PN+Gln组动物每天肠内及肠外营养液中添加0.4g/Kgd纯度为98%的丙氨酞-谷胺酞胺双肽（力肽注射剂，华瑞公司产品）。所有实验动物可自由饮水。营养制剂的剂量为每天250mL/kg，麻醉苏醒后2小时开始输注营养液，第1天输半量，第2天开始输全量。各组营养液当天配制，用微量注射器泵在24小时内均匀输注。

1.5实验方法

1.5.1肠内容物SIgA含量：取盲肠内容物，加入4ml生理盐水，4oC冰箱震荡过夜，4000rpm离心10分钟，取上清液按ELISA试剂盒（购自上海蓝基生物科技有限公司）操作方法检测。

1.5.2肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞检测：在大鼠小肠的近端空肠5cm以下处取2cm长的空肠（回盲部肠管）匀浆后，4℃条件下，准确称量0.3g肠组织，剪碎，移入玻璃匀浆器，然后加入预冷的生理盐水至总体积3mL，在冰浴中用玻璃匀浆器仔细研磨，制备10%肠组织匀浆。将匀浆液低温离心（4℃，3500rpm）10min，取上清液，使用流式细胞仪（美国贝克曼公司的COULTER？DNAPREP？ReagentsKit）测定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比及CD68+巨噬细胞的百分比。

1.6统计学方法数据采用SPSS17.0统计软件进行处理分析，以数据用x±s表示，组间参数及两组参数之间的比较采用相关样本的非参数检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1SAP组和对照组大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物S-IgA的含量明显降低，差别具有统计学意义;与对照组相比，SAP组大鼠肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，差别具有统计学意义。详见下表1。

表1SAP组和对照组大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

2.2EN组及PN组SAP大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差别具有统计学意义（F值依次为98.305、111.37、23.158、89.848、86.895，P值均<0.001）;与PN组相比，PN+Gln组大鼠S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差别无统计学意义（F值依次为0.039、3.052、2.346、2.461、0.625，P值依次为0.846、0.098、0.143、0.134、0.44）。详见下表2。

表2EN组及PN组SAP大鼠肠内容物S-IgA的含量及肠上皮淋巴细胞分布

3.讨论

重症急性胰腺炎是临床常见重症疾病，因其易破坏肠道功能屏障导致胰腺组织细菌感染、全身炎症反应综合征甚至多器官功能衰竭，故病情凶险，病程进展快，死亡率高达20%-30%[2]。如何保护肠道功能屏障是治疗重症急性胰腺炎的首要任务，而肠道免疫功能屏障是肠道功能屏障的重要组成部分，其在保护SAP肠道功能屏障中的作用日益突出。大量实验结果[3-4]表明，SAP时谷氨酰胺明显缺乏，补充谷氨酰胺具有治疗SAP的作用，而谷氨酰胺对SAP是否具有保护肠道免疫功能屏障的作用目前研究较少。

肠道免疫屏障由肠上皮细胞（intestinalepithelialcell，iEC）、肠上皮内淋巴细胞（intestinalintraepitheliallymphocyte，iIEL）、固有层淋巴细胞（laminapropriallymphocyte，LPL）、派伊氏结（peyer'patch，PP）和肠系膜淋巴结等肠道组织及肠道浆细胞分泌型免疫球蛋白A（sIgA）构成[5]。其主要功能是由相关淋巴样组织通过分泌sIgA发挥抗感染的体液免疫以及细胞毒性的细胞免疫。

本研究结果表明，与对照组相比，SAP组大鼠肠内容物细菌S-IgA的含量、肠上皮细胞中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显降低，说明SAP时肠道免疫功能屏障明显受损。由于谷氨酰胺不稳定，常与丙氨酸结合制成稳定的Gln双肽。本实验中，分别应用肠内营养及肠外营养两种不同途径添加Gln。结果显示，与EN组相比，EN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量明显升高，肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平明显升高，差别具有统计学意义;与PN组相比，PN+Gln组大鼠肠内容物S-IgA含量、肠上皮内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞和CD68+巨噬细胞表达水平升高，但差别无统计学意义。说明肠内营养添加Gln具有明显提高肠道局部体液免疫及细胞免疫，保护肠道免疫功能屏障，从而达到治疗SAP的作用。

参考文献：

[1]GerlachH.Riskmanagementinpatientswithsevereacutepancreatitis[J].CritCare，2004;8（6）：430

[2]AhoHJ，KoskensaloSM，NevalainenTJ.Experimentalpancreatitisintherat.Sodiumtaurocholateinducedacutehaemorrhagicpancreatitis[J].ScandJGastroenterol，1980，15（4）：411-416.

[3]GamrinL，EssenP，ForsbergAM，HultmanE，WernermanJ：Adescriptivestudyofskeletalmusclemetabolismincriticallyillpatients：freeaminoacids，energy-richphosphates，protein，nucleicacids，fat，water，andelectrolytes.CritCareMed1996，24：575-583.

细胞生物学定义篇3

细胞的全能性是本节课教学的难点，由高度分化的细胞能否继续进行分化引出细胞的全能性，在细胞全能性教学中，尽量以图片实物等感官教学为主，以使学生易于理解。

二、教学目标

（1）说明细胞的分化；

（2）举例说明细胞的全能性。

三、教学设计

1.创设情境，设疑导入

幻灯片展示“胎儿发育的过程图”，设计问题：你是由什么细胞发育而来的？成年后你身体内大约有多少个细胞？你知道你身体内的细胞有多少种吗？让学生通过观察图片，学生思考得出“人是从受精卵发育而来，成年后大致有40万亿～60万亿个细胞，这是通过细胞的分裂形成的，这些细胞分为200多种。”从而引出课题“细胞的分化”。

2.通过资料分析，引导学生展开讨论，总结细胞分化的定义等

指导学生观察PPT上展示的几种人体细胞，提出问题：①已经分化的人体细胞最初来源于哪个细胞？②它们存在哪些方面的不同？③它们还能再变回受精卵吗？通过课题引入的问题分析以及图片，学生能够明确这些已经分化的体细胞都是受精卵的后代，它们在形态和生理功能方面存在差异，从而引导学生总结出“细胞分化”的定义。

3.分析细胞分裂与分化的关系，认清两者之间的联系与区别

引导学生分析PPT展示的图片，思考：（1）①过程表示什么过程？引起了怎样的变化？各细胞中的遗传物质改变了吗？（2）②过程表示什么过程？引起了怎样的变化？各细胞中的遗传物质改变了吗？

4.利用自制教具，引导学生探究细胞分化的机理

引导学生思考“细胞分化是由细胞中的什么物质决定的？”，引发学生提出假说：假说①：细胞的分化是由遗传物质（DNA）决定的；假说②：细胞的分化是由蛋白质决定的。教师将学生的争论搁置，展示资料，思考：通过资料你获得了哪些信息？得出了哪些结论？为什么各细胞中的基因相同，而蛋白质种类不同呢？

5.看图说话，亲眼观察组培样品，体会细胞全能性的应用

细胞生物学定义篇4

【关键词】腺苷;细胞生长;细胞周期;存活

[Abstract]Objective:Tostudytheinfluenceofincreasedconcentrationofadenosineoncellsunderenvironmentalcrisis.Methods:Highconcentrationofadenosinewasaddedtocellculturestosimulateenvironmentalcrisis，andthecellproliferation，cellcycleandsurvivalofcellswereexamined.Results:Adenosineinhibitedcellproliferationbutdidnotinducecellapoptosis.Adenosineinhibitedcellcycleandpromotedcellsurvivalundernoglucosecondition.Conclusion:Highconcentrationofadenosinepromotescellsurvivalbyinhibitingcellproliferation.

[Keywords]adenosine;cellproliferaton;cellcycle;survival

腺苷是细胞内的天然代谢产物之一。当细胞遭遇低氧低糖等环境生存压力时，细胞内外的腺苷浓度将急剧升高[1-3]。然而这种高浓度的腺苷对细胞产生的影响及其生物学意义鲜有报道。本研究通过向细胞培养物中添加高浓度的腺苷，模拟了低氧低糖环境下细胞内外腺苷浓度升高这一事件，同时检测这种高浓度下细胞的生长增殖、细胞周期、凋亡等事件，阐明危机情况下腺苷对细胞的影响，为进一步理解腺苷在机体细胞应对暂时性缺血等病理情况时发挥的作用提供理论基础。

1材料和方法

1.1细胞培养及相关试剂

HEK293T细胞、MEF细胞均购自ATCC公司，置于含10%新生牛血清的DMEM培养基中，在37℃、体积分数为0.05的CO2孵育箱中培养。RNaseA、DMSO、MTT和PI购自Sigmaaldrich公司。

1.2显微镜观察细胞密度

将对数生长期HEK293T细胞以(1～2)×104每孔接种于24孔板。置37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中培养过夜后进行腺苷处理。腺苷处理前及处理24h后分别在显微镜下拍照。

1.3MTT法测细胞活力

在24孔板里按每孔(1～2)×104个细胞接种400μl细胞悬液，置37℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱中孵育过夜，进行药物处理24h或48h后;每孔加入40μlMTT溶液(5mg·ml-1)，37℃反应4h;小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入100μl二甲亚砜(DMSO)，室温孵育10min;振荡后通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值，参比波长为690nm，对每孔的光吸收值进行定量测定，每组设定3复孔。

1.4PI法测定细胞周期

胰酶消化细胞后，用含血清的培养基终止消化，离心收集细胞;然后用预冷的PBS洗涤细胞，弃上清，用100μlPBS悬浮细胞;冷的体积分数为0.75的酒精1ml滴加固定细胞(边振荡，边滴加);4℃固定过夜;2000r·min-1离心3min;弃上清，PBS洗涤;2000r·min-1离心3min;1×RNase(10～15μg·ml-1)，消化15min;PI染色10min，利用流式细胞仪检测分析细胞周期。

1.5细胞凋亡检测

收集细胞，PBS洗涤细胞，离心弃上清;用结合缓冲液洗涤细胞，离心弃上清，400μl结合缓冲液悬浮细胞;加AnnexinVEGFP，冰上避光20min;每管加1μlPI(500μg·ml-1)，10min后利用流式细胞仪检测细胞凋亡。

2结果

2.1高浓度腺苷抑制细胞增殖但不诱导细胞凋亡

通过观察细胞密度可以看到，加入高浓度腺苷后，HEK293T细胞密度明显降低(图1A);MTT实验结果显示腺苷处理HEK293T细胞24或48h后，HEK293T细胞活力随着腺苷浓度的上升逐渐降低(图1B);说明高浓度腺苷可以抑制细胞的增殖(图1B);流式细胞仪检测细胞凋亡显示高浓度腺苷处理细胞24h并没有显著诱导细胞凋亡(图1C)。

2.2高浓度腺苷通过抑制细胞周期从而抑制细胞增殖

细胞通过细胞周期而不断地自我增殖，我们利用流式细胞术检测腺苷是否通过抑制细胞周期的进行从而抑制细胞增殖。结果显示，高浓度腺苷明显改变HEK293T细胞周期的进程，导致G0/G1期和G2/M期细胞明显增多，呈阻滞现象(图2)。说明腺苷通过抑制细胞周期的进行从而抑制了细胞的增殖。腺苷可以通过细胞膜上的转运载体蛋白运输进入细胞质内发挥作用[4-5]，也可以通过与细胞膜受体结合发挥生物学功能[6-7]。我们通过向细胞培养物加入腺苷转运蛋白抑制剂发现，加入转运载体蛋白抑制剂缓解了腺苷对细胞的抑制作用，说明腺苷需要通过转运载体蛋白进入细胞内发挥其抑制细胞周期的作用(数据未公开)。

A.腺苷抑制细胞增殖的细胞形态图;B.MTT法测定细胞活力(纵坐标为加药后的细胞活力占对照组细胞活力的比值);C.用1mmol·L-1腺苷处理HEK293T细胞24h，无凋亡细胞图1腺苷抑制细胞增殖

A.CellmorphologyofHEK293Tafteradenosinetreatmentfor24h;B.MTTassayofHEK293Tafteradenosinetreatment(Yaxisrepresentstheratioofproliferatingactivityofcellstreatedwithadenosinetocontrolgroup);C.ApoptosisofHEK293Taftertreatmentwith1mmol·L-1concentrationofadenosine

2.3高浓度腺苷提高细胞在无糖环境中的存活率

在无糖条件下，细胞会大量分泌腺苷[2-3]，而腺苷可以抑制细胞周期的进行。因此，检验腺苷是否通过抑制细胞周期的进行从而提高细胞的存活率是十分有意义的。我们利用无糖培养基对MEF细胞进行连续培养32h，结果显示(图3A)，3mmol·L-1腺苷可以明显促进MEF细胞的存活;类似的在无糖条件下连续培养HEK293T细胞24h，3mmol·L-1腺苷可以明显减少细胞凋亡的发生(图3B、C)。

A.MEF细胞在无糖条件下连续培养32h，对照组加DMSO，另一组加3mmol·L-1Adenosine处理;B.HEK293T细胞先用DMSO或Adenosine预处理4h，然后换无糖培养基培养24h;C.图B中HEK293T细胞的凋亡分析结果

3讨论

低糖或无糖环境是细胞经常遭遇的危机环境，细胞怎样度过这种环境危机一直是研究的热点之一。在无糖条件下，细胞会大量分泌腺苷，关于这种分泌的高浓度腺苷对细胞的影响及其生物学意义鲜有报道，原因是腺苷在胞内外浓度的测定存在一定的困难，而且腺苷分子并不稳定，可以被细胞内的腺苷脱氨酶的脱氨作用代谢分解[1]。我们的研究发现，随着作用时间的延长，腺苷对细胞周期的抑制效果会有所下降。这种情况可能与腺苷分子的不稳定等因素有关。

我们的研究表明，细胞在无糖环境下分泌大量腺苷是细胞的一种自我保护机制。这种高浓度的腺苷通过抑制细胞周期的进行从而抑制细胞生长增殖，这种抑制作用降低细胞内的能量消耗从而提高了细胞的存活率。

总之，本研究揭示了腺苷通过抑制细胞周期的进行，有效地协助细胞度过遭遇的低糖生存危机，为临床上组织细胞在缺血环境下分泌大量腺苷的意义提供了一种生物学解释。

参考文献

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[5]THAMPYKG，BARNESEM.Adenosinetransportbyprimaryculturesofneuronsfromchickembryobrain[J].JNeurochem，1983，40(3):874879.

细胞生物学定义篇5

通讯作者：戴淼

【摘要】目的探讨载体表达的小干扰RNA（siRNA）影响卵巢癌耐药细胞株Twist基因的表达、促进凋亡并逆转其阿霉素耐药的可行性。方法体外构建Twist小发卡状RNA（shRNA）的表达质粒，脂质体法介导将其转染入SKOV3/ADM细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测TwistmRNA的表达；使用免疫细胞化学法（ICC）检测Twist蛋白的表达；使用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定各组细胞对阿霉素的半数抑制浓度（IC50）；流式细胞术检测其对卵巢癌细胞凋亡的影响。结果TwistshRNA转染组细胞TwistmRNA的表达与其他两组相比明显减弱，Twist蛋白表达明显下调，差异均有统计学意义（P

【关键词】卵巢癌肿瘤；Twist；RNA干扰；逆转耐药；凋亡

化疗为卵巢癌主要的辅助治疗手段，以阿霉素为基础的联合化疗使卵巢癌患者的生存时间明显延长，但其五年生存率却无明显提高,主要原因是随着化疗时间的延长，肿瘤细胞逐渐对各种化疗药物尤其是阿霉素产生了耐药性。因此,阿霉素化疗增敏剂的研究在临床上有重要意义。Twist是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因,与细胞凋亡、肿瘤转移和血管生成密切相关,并在多数恶性肿瘤中过度表达［1，2］。另外，抑制Twist表达，能增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3，4］。本研究旨在研究干扰Twist基因对卵巢癌耐药细胞SKOV3/ADM的耐药性影响，以进一步阐明卵巢癌的耐药机制，为临床提供新的治疗方案。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1细胞株和菌株人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/ADM购自广西医科大学附属肿瘤医院，其亲本细胞株SKOV3由潍坊医学院肿瘤内科馈赠；大肠杆菌DH5a由潍坊医学院微生物学教研室保存。

1.1.2主要试剂及来源空质粒pSilencer2.1-U6neo购自Ambion公司；大提质粒试剂盒购于Omega公司；阳离子脂质体转染试剂盒Lipofectamine2000购自普利莱公司；TrizolRNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶、dNTP均购自上海生工公司；兔抗人Twist－抗、SABC（兔IgG）－POD试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；阿霉素为齐鲁制药冻干型制剂；MTT（四甲基偶氮唑盐）为Sigma公司产品。

1.2方法

1.2.1小干扰RNA的构建利用Ambion公司在线设计程序，设计为能表达其发卡结构的小RNA（shRNA）的DNA序列顺义链和反义链。正义和反义寡核苷酸链由上海生工合成，各由2.0OD加ddH20（去离子水）配制成3mg/ml溶液。

1.2.2重组质粒pTWIST-shRNA鉴定和纯化已构建好的两条寡核苷酸链退火形成双链，与质粒pSilencer2.1-U6neo连接为pTWIST-shRNA转化大肠杆菌DH5a，用含氨苄青霉素的LB平板筛选，挑选阳性克隆并提取质粒，经BamHI、HindⅢ双酶切鉴定，并测序证实插入序列为所设计的发卡序列。按大提质粒试剂盒的步骤提取并纯化质粒，待转染。

1.2.3细胞培养与转染将对数生长的SKOV3/ADM细胞加入阿霉素使其终浓度为20μg/ml，作用1h。间歇作用诱导细胞耐药，采用该方法连续诱导3次。耐药的SKOV3/ADM细胞分4组进行转染：空载体转染组、非特异转染组、pTWIST-shRNA转染组和非转染组。转染前24h进行细胞计数，接种于6孔板，每孔2×105个细胞，细胞达90%融合时，进行转染。转染Twist-siRNA后48h收集细胞分别进行RT-PCR和免疫细胞化学实验。

1.2.4RT-PCR检测TwistmRNA表达按Trizol试剂说明书的要求提取各组细胞总RNA。按ReverseTranscriptionSystem的说明书采用特异性下游引物法反转录成cDNA。聚合酶链（PCR）反应，Twist上游引物：5'-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3'；下游引物：5'-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3'，扩增产物长262bp。以β-actin为内参照，94℃预变性5min，94℃变性30s,55℃退火30s，72℃延伸1min45s，循环30次后，72℃延伸10min,4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外线透射观察仪观测、照相，用BandScan图像分析软件对结果进行分析，以Twist与β-actin相对比值，比较各组细胞TwistmRNA的表达差异。

1.2.5免疫组化法检测细胞Twist表达未转染及转染48h后的细胞爬片，然后按照说明书进行固定、染色、脱色、封片，在显微镜下观察并照相。

1.2.6MTT检测细胞对阿霉素的半数抑制浓度（IC50）实验分四组：空载体转染组、非特异转染组、pTWIST-shRNA转染组和非转染组。取对数生长的SKOV3/ADM,制成1×105个/ml细胞悬液，接种96孔板，每孔100μl培养液，约含2×103个细胞，37℃、5%CO2培养过夜；转染组细胞在细胞90%融合时开始转染，转染24h后设6个加药孔，分别加入不同浓度的DDP（终浓度1.25μg/ml至40μg/ml），药物浓度按两倍比增加，每样本设4个平行孔，对照组不加药物，另设调零孔加RPMI1640培养液，每孔200μl。转染72h后按照说明书进行MTT检测。

1.2.7流式细胞技术检测细胞分组:SKOV3/ADM、SKOV3/ADM+阿霉素、非特异转染组+阿霉素、特异性转染组+阿霉素。将SKOV3/ADM细胞接种于6孔板中，转染后48h后加0.01mol/L阿霉素。24h后收集细胞，用PBS洗涤两遍，再用-20℃预冷的75%乙醇固定18h。流式细胞仪检测，重复检测3次。

1.3统计学分析采用SPSS1310软件进行单因素方差分析、独立样本t检验（组间）配对样本t检验（组内）处理,实验数据以均数±标准差（x±s）表示，P

2结果

2.1Twist-siRNA的鉴定和定量Twist-siRNA经BamHⅠ、HindⅢ双酶切，其产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳出现两条带，条带的位置与设计相符。质粒的测序结果证明插入片段的序列完全正确。将合成的siRNA稀释后测定260nm的吸光度值提示合成的siRNA产量在200～380μg/ml之间。

2.2RNA干扰前后SKOV3/ADM细胞中Twist基因的转录水平各组细胞在相对于262bp处均见扩增条带，且在100bp以上处可见内参β-actin的条带，各组间其亮度差异无统计学意义（P＞0.05）。用BandScan图像分析软件对结果进行分析，pTWIST-shRNA转染组与空载体转染组、非特异转染组和非转染组比较，差异均有统计学意义（P

2.3pTWIST-shRNA对细胞Twist蛋白质表达的影响免疫细胞化学染色法显示，pTWIST-shRNA转染组细胞Twist蛋白表达明显低于非转染组、空载体转染组和非特异性转染组，差异有统计学意义（P

2.4MTT检测各组细胞对阿霉素的半数抑制浓度不同质粒转染入各组细胞，并暴露于阿霉素48h后，各组细胞存活率均随阿霉素浓度的增加而降低，其异性转染组降低最为显著。非转染组SKOV3/ADM的IC50（16.54±0.23）μg/ml，其亲本细胞SKOV3为（6.04±0.11）μg/ml，测其耐药指数约为2.8，与该耐药细胞株所属医院提供的数值相符；pTWIST-shRNA转染后的SKOV3/ADM细胞对阿霉素的敏感性提高了约2.5倍，空质粒转染组与其他两组相比差异均有统计学意义（P0.05）。

2.5pTWIST-shRNA对SKOV3/ADM周期和凋亡的影响经阿霉素作用后，特异性转染组的细胞凋亡率、G0/G1期细胞比例都明显高于空白对照组、未转染细胞、非特异转染组，差异均有统计学意义（P

3讨论

卵巢癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位，在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于卵巢癌约11万人，占全世界卵巢癌死亡人数的45%。根治性切除者五年生存率达53.0%，其中多为小卵巢癌或大卵巢癌缩小后切除者，姑息性切除仅12.5%，药物治疗少见生存5年以上者。治疗的难点为卵巢癌细胞的转移及对化疗药物――尤其是一线化疗药阿霉素、顺铂等产生耐药性,严重阻断了化疗药物的抗肿瘤效应，从而导致综合治疗的失败。而耐药性的产生与肿瘤细胞对凋亡的敏感性降低有关［3，4］。国内外大多数学者主要采用RNAi技术对多药耐药基因MDR［5］、核苷酸切除修复家族成员ERCC1等基因进行研究，对Twist的研究较少。

Twist是转录因子家族中编码锌指蛋白的基因,与细胞凋亡、肿瘤转移和血管生成密切相关,并在多数恶性肿瘤中过度表达［1，2］。另外，抑制Twist表达增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3,4］。本实验针对Twist基因设计的特异性序列与质粒pSilencer2.1-U6neo连接为重组质粒pTWIST-shRNA，转染入卵巢癌耐药细胞株SKOV3/ADM，研究RNAi技术对SKOV3/ADM中Twist基因表达和凋亡的影响，及耐药细胞株对化疗药物阿霉素的敏感性的变化，证实RNAi技术可以从多方面抑制Twist基因的表达，从而逆转SKOV3/ADM对化疗药物的耐药性。

3.1重组质粒的构建选取Twist基因cDNA序列起始点280个核苷酸之后的连续19nt作为RNA干扰的特异性序列，设计为能表达其发卡结构的小RNA（shRNA）的DNA序列，两端加上BamHI、HindⅢ酶切位点，两条寡核苷酸链退火形成双链，与线性化质粒pSilencer2.1-U6neo连接，取名为pTWIST-shRNA。克隆后重新提取质粒pTWIST-shRNA，经BamHⅠ、HindⅢ双酶切后测序，其序列与所设计的特异性序列相符，证明特异性质粒重组成功。

3.2RNAi技术逆转SKOV3/ADM细胞阿霉素耐药的机制本实验是将针对Twist设计的双链RNA寡核苷酸导入SKOV3/ADM,其与TWIST基因的mRNA互补结合并使之降解，沉默Twist基因，降低其在卵巢癌耐药细胞株中的表达，逆转了耐药细胞株对阿霉素的耐药性。

3.3靶向Twist基因的小干扰RNA对SKOV3/ADM细胞凋亡的影响研究表明RNA干扰有很强的抑制目的基因的作用［6］，比反义寡核苷酸抑制目的基因的效果更强。多种肿瘤利用此方法对Twist基因的靶向进行了研究,扰的肿瘤细胞出现生长抑制、凋亡增加、侵袭性下降及对化疗药物敏感性增强的现象［1～4］。上述研究均为笔者将Twist基因作为基因治疗靶，特异性诱导卵巢癌耐药细胞凋亡、逆转其化疗耐药性提供了有力的理论依据。

综上所述，RNA干扰技术有效地调节SKOV3/ADM细胞中Twist基因的表达，能够逆转卵巢癌耐药细胞对化疗药物的耐药性，成为抗肿瘤基因治疗的新方法。

参考文献

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细胞生物学定义篇6

[摘要]目的：通过探讨机械刺激对大鼠“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞的压力信号生物转换作用，为腧穴“感受刺激，防治痰病”的现代医学生物学机制提供理论与实验依据。方法：体外培养大鼠“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞，对细胞进行形态学鉴定后，实施压力刺激并检测细胞外培养液中前列腺素E2(PGE2)和白细胞介素－6(IL-6)含量的变化。结果：“足三里”穴及穴旁区域的筋膜组织细胞主要都是成纤维细胞，压力刺激均能够促进细胞PGE2和IL-6合成释放的增加，差异有统计学意义。结论：腧穴与非穴的筋膜组织成纤维细胞皆能直接感受刺激，从而将机械信号转换为生物信号。

[主题词]穴，足三里；成纤维细胞／针灸效应，信号传递；物理刺激

文章编号：0255-2930(2007)02-0135-06

中图分类号：R245．2文献标识码：A

腧穴是人体脏腑经络气血输注并散发于体表的部位，它不仅能够反映病候以协助诊断，更重要的是，腧穴在感受毫针针刺与推拿按摩的机械性刺激后，还能激发出本身所固有的调节功能，从而发挥其防治疾病的作用。那么，腧穴究竟是如何感受机械性刺激，并将无机的机械信号转换为有机的生物信号的呢?目前，对此大多是从神经生物学机制的角度进行解释的，但实际上，在实施机械刺激的腧穴局部，除了各种神经装置外，其他组织和细胞也是直接暴露于治疗操作的力学环境之下的，理论上就更有可能主动地参与腧穴“感受刺激”的信号转换过程。由于在腧穴特性的研究中，“足三里”穴有着典型的代表意义，因此，对其附着组织的主要细胞群体――筋膜结缔组织成纤维细胞机械力学信号生物转换作用的研究，将有助于补充神经生物学机制对腧穴研究的不足，从而更全面地阐述腧穴“感受刺激，防治疾病”的一般生物学原理。

1材料与方法

1．1材料

(1)实验动物、主要培养试剂及检测试剂

健康3月龄雄性SD大鼠32只(由四川抗菌工业研究所动物中心提供，合格证：川实动管质第041307号)，DMEM培养基(GIBCO，USA)，小牛血清(GIBCO，USA)，胰蛋白酶(DIFCO，USA)，EDTA(SIGMA，Israel)，PGE试剂盒(上海森雄公司)，IL-6试剂盒(深圳晶美公司)。

(2)主要实验器材

C02培养箱(Heraeus，Germany)，倒置相差显微镜及组像系统、体视显微镜(olympus，Japan)，离心机(北京医用分析仪器厂)，气压传导压力加载装置(自制)，HTS7000Plus多孔板(紫外／荧光／可见光)高效分析仪(PE，USA)，6孔培养板，100mL细胞培养瓶，微量加样枪，滤菌器等。

1．2腧穴与非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代

(1)腧穴筋膜组织细胞的原代培养及传代

对32只SD大鼠分别进行“足三里”穴区皮下组织块取样，体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织，按酶消化法，无菌条件下剪碎组织块，移入无菌小瓶中，加入O．25％胰酶1mL，混匀，37℃，5％C02孵箱内培养10～15min，每5min振摇1次；加入含10％小牛血清的DMEM培养基终止消化；离心，1000r／min，8min，收集筋膜组织细胞；然后加入含20％小牛血清的DMEM培养基，混匀；转移至100mL培养瓶中，CO孵箱内继续培养。细胞贴壁后，每隔2天换液，每日观察生长状况，细胞生长达80％融合时，传代培养，镜下连续记录细胞形态并进行细胞形态学鉴定。

(2)非穴筋膜组织细胞的原代培养及传代

对上述大鼠进行“足三里”穴区皮下组织块取样的同时，于穴旁5分以上距离区域同步切取皮下组织块，体视显微镜下分离其中的筋膜结缔组织，按相同方法获取筋膜组织细胞并进行原代培养、传代培养、生长记录及细胞形态学鉴定。

1．3细胞力学加载实验

(1)气压传导压力加载装置

气压传导压力加载装置――自制带压力表及压力气囊的压力锅；装置设计原理采用气体传导静压力的静压加压法；装置制作方法参考相关文献方法进行。

(2)细胞在6孔板上的接种培养及加力前处理

分别取第7～8代腧穴筋膜组织细胞和非穴筋膜组织细胞，弃培养液，加入O．25％胰酶和O．1％EDTA混合消化液消化细胞，约3～5min；当瓶底出现针孔样透明时，用含10％小牛血清的DMEM终止消化细胞，调整细胞密度，按2×10。／mL接种于6孔培养板；显微镜下见细胞完全贴壁生长后，继续培养72h；弃含10％小牛血清的DMEM培养液，准确更换含5％小牛血清的DMEM培养液3mL，再培养24h，使细胞同步化，备用。

(3)实验设计及操作

①实验设计

实验采用3因素(细胞因素、力学因素和时间因素)析因方差实验设计进行。将实验大鼠腧穴筋膜组织细胞样本(n=32)随机分为压力刺激组(n=16)和空白对照组(n：16)，每个组下根据不同处理时间又各设4h和8h共两个检测点，每个检测点均包含8个样本；同时将非穴筋膜组织细胞进行相同分组处理，从而动态比较压力刺激对腧穴与非穴筋膜组织细胞生物学状况的影响。

②空白对照组处理

将空白对照组细胞置于37℃含5％CO孵箱中，不施加压力刺激，于压力组实验开始的同时，分别继续培养4h和8h，于每个时间点上取出细胞培养板，提取细胞培养液以备检测。

③压力刺激组处理

将压力刺激组细胞置于压力装置中，然后移入37。C含59／6CO孵箱中，以孵箱内59／CO加95％空气组成的混合气体加压，维持压力装置内的压力达50kPa，分别继续培养4h和8h，于每个时间点上取出细胞培养板，提取细胞培养液以备检测。

1．4指标检测

(1)细胞鉴定采用形态学鉴定方法进行。

(2)PGE2测定采用上海森雄公司酶联免疫吸附竞争试剂盒法。

(3)IL-6测定采用深圳晶美公司酶联免疫吸附试剂盒法。

1．5统计学处理

形态学资料采用直接对比法；数据资料采用SPSS12．0统计软件中广义线性模型(GeneralLin―earModel，GLM)的单变量(Univariate)过程析因方差分析(FactorialAnalysis)进行检验，比较细胞因素、力学因素和时间因素在实验组与对照组之间的差异有无统计学意义。

2结果

2．1细胞鉴定

在倒置相差显微镜下，腧穴与非穴的筋膜组织细胞在传代接种时，由于细胞密度低、数量少且分散，细胞开始贴壁生长时呈小圆形或短梭形(见图1、图2箭头所示)；当细胞生长达到一定密度后生长融合，细胞梭形变长，胞体丰满，胞浆均匀，核圆形或

卵圆形，核仁清晰，细胞群体单层生长，呈漩涡状、栅栏状、放射状外观(见图3、图4箭头所示)。

两种细胞的形态学特点都符合正常成纤维细胞在形态学上的共同特征。因此，从形态学上可以鉴定本次实验的实验对象――腧穴与非穴的筋膜组织细胞均主要为成纤维细胞，且腧穴与非穴成纤维细胞在形态学上无明显差异。

2．2压力刺激对腧穴与非穴成纤维细胞PGE合成释放的影响

不同实验因素对成纤维细胞合成释放PGE2的影响不同，见表1。统计分析显示：力学因素、细胞因素与时间因素之间，力学因素是促进腧穴与非穴成纤维细胞合成释放PGE的主要因素，其差异有统计学意义(P＜0．05)；而细胞因素和时间因素对PGE合成释放的影响均无统计学意义(P＞0．05)。

2．3压力刺激对腧穴与非穴成纤维细胞IL-6合成释放的影响

不同实验因素对成纤维细胞合成释放IL－6的影响见表2。经统计分析，力学因素、细胞因素与时间因素之间，力学因素是促进腧穴与非穴成纤维细胞合成释放IL－6的主要因素，其差异有统计学意义(P＜0．01)，细胞因素和时间因素对IL－6合成释放的影响均无统计学意义(P＞0．05)。

3讨论

3．1筋膜结缔组织成纤维细胞是经脉腧穴主要组织的主要细胞群体

通过多年的反复研究，近年来，越来越多的经络腧穴研究者开始逐步把目光更多地注视于过去没有引起充分重视的筋膜结缔组织上来，认为经络穴位的物质基础是在以结缔组织为基础，连带其中的血管、神经丛和淋巴管等交织而成的复杂体系之中。这个由结缔组织结构联系起来的体系，不仅是各种器官、组织和细胞的载体，而且与细胞进行着物质、信息和能量的传输和调节，构成一个对生物机体内外环境能作出反应的动态平衡体系。

结缔组织起源于胚胎时期的间充质，在体内广泛分布，一般认为具有连接、支持、营养和保护等多种功能。但目前发现结缔组织的许多重要功能尚未充分认识，其细胞组成以未分化的潜能细胞为主，其中，细胞数量最多的是成纤维细胞。

3．2压力是毫针针刺和推拿按摩的基本力学作用形式之一

从历史发展的角度看，对经脉和穴位最原始的刺激方式应是以手指(或手掌)对阿是穴的按压(或按揉)。生产力的发展促使人类发明了针具，针具的使用使得人手的功能得到进一步延伸。原始的针具大而粗糙，针刺时，穴位除了明显的组织损伤外，针体也会对其周围组织产生明显的侧向挤压作用，因此压力刺激是腧穴应力刺激最原始的一种作用方式。

随着推拿按摩治疗技术的发展，手法逐渐多样化，而与此同时，生产力的发展也使得针具的生产工艺日益精细，毫针的各种操作手法日渐丰富起来，这时，压力刺激已不再是针推治疗的主要力学刺激形式，其他力学形式(如提插力、捻转力、牵张力、摩擦力和剪切力)的刺激作用显得越来越重要，但仔细分析，这些变化都不能否定压力刺激仍然是针推治疗过程中腧穴应力刺激最基本的力学作用方式之一。

3．3腧穴感受刺激现代研究的困境与思考

现代研究认为，腧穴通过各种穴位感受器感受刺激，穴位感受器的物质基础就是能将刺激转换为神经冲动的各种感觉感受器。这些穴位感受器将机械信号转换为生物电信号(神经冲动)后，一方面传递到大脑皮质形成针感，另一方面通过各级中枢的反射或调制，对内脏和躯体活动进行调控(神经调节或神经一体液调节)。临床针推治疗的适应证广泛，目前对其作用机理的现代研究，究其根本几乎都是在该神经生物机制的基础上进行解释的，因为一旦脱离该机制，已有的经络腧穴研究将无法解决机械信号输入、整合，以及对其他系统的输出、调控问题，因此，神经生物学机制似乎是腧穴“感受刺激，防治疾病”惟一的生物学机制。然而，当神经系统发生疾患时，在信号的感受、传递、整合或者传出等诸多环节大多存在功能障碍，而为什么针推临床的很多有效病种恰恰又是神经系统方面的疾病呢?

重新审视一个常见的针灸临床现象时笔者发现，一部分患者在开始接受针刺治疗时，即便是取穴准确，针刺操作得当，还是会遇到患者不得气的情况。这时，医生通常会采取“留针候气”或“循弹催气”的方法以促使患者得气。事实上，借助于留针的静态机械刺激，或通过循弹手法的动态机械刺激，大多数患者是能够产生酸胀得气感的；即便是始终没有得气感出现的患者中，在治疗结束时，也仍然还是有部分患者能够体现出一定的治疗效应的。根据已有的科学基础，可以肯定的是：穴位感受器的物质基础虽然属于神经组织，但神经组织不仅能够感受机械刺激，而且同机体的其他组织器官一样，同样能够感受周围生化环境的变化，从而调整自身的功能，适应正常生理活动的需要。因此，在理论上，对“留针候气”或“循弹催气”等上述临床现象的解释就可能是，不依赖于神经生物学机制，穴区的其他组织细胞同时也直接参与了机械信号向生物信号的转换过程；这种生物信号可能包含某些生化信号分子，这些分子在细胞间隙的弥散，一方面作用于穴位感受器，促进了对机械刺激失敏的、功能低下的穴位感受器重新恢复正常的机械信号感受功能；另一方面，作用于其他组织和器官(包括神经组织的其他部分)，介导了腧穴其他不同治疗功能的发挥。但是，如果要证实腧穴存在非神经途径的作用机制，其关键的第一步就是要证明腧穴的非神经组织和细胞，特别是基本组织的主要细胞――筋膜结缔组织成纤维细胞究竟能不能感受机械力的刺激，能不能将机械信号转换为生物化学信号。

研究中，最理想的实验方法是直接探讨腧穴筋膜成纤维细胞在机体内的生理状态下对机械刺激诱导的各种反应。可是神经系统的敏感性、复杂性以及体内众多的环境因素(如血液循环、组织液流动等)将使体内研究难以区别单一效应或特定的联合效应，直接控制或检测以上诸多理化因素的影响是很困难的。所以，为了屏蔽这些因素的干扰，尝试体外培养腧穴筋膜组织成纤维细胞，进行离体的细胞力学刺激就成为本次研究的实验手段。

3．4腧穴筋膜结缔组织成纤维细胞机械信号生物转换作用的针灸推拿学意义

(1)腧穴与非穴筋膜结缔组织成纤维细胞机械信号生物转换作用的差别研究

此次研究选取“足三里”穴筋膜组织成纤维细胞为研究对象，“足三里”属胃经合穴，是人体重要穴位之一，在腧穴特性的研究中有广泛的代表意义；选取“足三里”穴旁开5分以上距离的筋膜组织成纤维细胞为非穴对照组的研究对象。研究发现，腧穴成纤维细胞可以感受力学刺激，促进细胞合成释放PGE和IL－6，从而将无机的机械刺激信号转换为有机的生物化学信号；研究同时也发现，腧穴与非穴成纤维细胞对力学刺激的机械信号生物转换作用在实验中并无显著性差异。

回顾腧穴感受力学刺激的生物学机制时，笔者发现，首先从神经生物学机制上看：腧穴与非穴的神

经感受装置在结构上本身并无本质的不同，只是穴区的神经感受装置分布比非穴区多，但就相同的神经感受装置而言，其相同机械刺激信号的生物转换机制目前也并未见有不同报道；其次从非神经生物学机制上看：现代医学生物学多个领域的研究其实已经证实，机体其他广泛分布的组织细胞同样能够感受各种应力刺激，静态、动态生理力学刺激和外界应力刺激对细胞的形态、生化特性有重要影响，细胞的一个自伺放大机制可使一个短暂的刺激如应力刺激转换为一个持续的细胞反应，机械力对组织细胞的作用类似激素和其他生物活性物质，这些生化介质在将机械负荷转换为生物反应过程中起到了重要的作用。但针灸推拿学在该领域的基础研究，目前尚未见报道。

因此，虽然笔者此次研究并未发现腧穴与非穴筋膜组织成纤维细胞的机械信号生物转换作用有何明显差异，但是，如果考虑到整体状况下腧穴可以通过经脉进行生物信号级联传递的特性，那么重点研究腧穴筋膜组织细胞对力学刺激信号的生物转换作用，也是可以为全面认识腧穴的一般生物学特性、突破单一神经机制的限制提供新的实验依据的。

(2)压力刺激促进腧穴成纤维细胞PGE合成释放的意义

PGE2是众多前列腺素(PGs)中的一种。PGs广泛分布于人和哺乳动物的组织与体液中，对机体神经、心血管、泌尿、生殖、呼吸、消化、造血和免疫等多种生理病理功能起着重要的调节作用。人和哺乳动物组织的各种细胞(除红细胞外)均可合成PGs。PGs的合成与释放，首先都要动员不饱和脂肪酸，这种不饱和脂肪酸存在于细胞膜结构中呈结合状态的磷脂内。当刺激因素作用于细胞时，细胞膜磷脂上的磷酸酯酶，主要是磷酸酯酶A(PLA)被激活，作用于磷脂，释放出不饱和脂肪酸――花生四烯酸(AA)，AA先在细胞微粒体经脂肪酸环加氧酶催化，将氧加到不饱和脂肪酸上，形成15羟前列腺内过氧化物――PGG2，然后经前列腺内过氧化酶的催化生成PGH2。PGG2和PGH2在水中不稳定，它们在37℃时半衰期为5min，可自动地或在酶的作用下转化为PGE2、PGD2a、PGF2、PGl2和血栓素A2(TXA2)等各种PGs。不同类型的PGs可因结构上的细小差异而显示不同的生理活性，有的甚至相反，因而各种PGs在体内含量的增减和相互比例的失调均可导致有关生理功能的变化，对许多疾病的病理学和治疗学都有重要意义，至于具体合成哪一种则取决于当时的生理需要。

压力作为针推机械刺激的一种基本力学作用形式，其促进腧穴筋膜结缔组织成纤维细胞PGE2合成释放的关键意义在于：①离体培养的腧穴筋膜组织成纤维细胞在压力作用下能够启动PGE的合成释放，这意味着整体状况下腧穴成纤维细胞的胞膜磷脂结构在针推压力的刺激作用下也可能发生改变，启动PGs的合成，从而将机械刺激信号转换为生物化学信号；②由于PGE2可以抑制血小板凝集，扩张局部小血管，促进局部血液循环，因此笔者认为，该机制可能是针推疗法(物理性治疗手段)本身具有“活血化瘀”功效的基本生物学原理之一；③PGs合成一旦启动，其具体合成哪一种则取决于当时的生理需要，笔者推测，这和针推治疗效应与机体当时生理状态有关的作用规律可能存在某种内在的必然联系。

(3)压力刺激促进腧穴成纤维细胞IL-6合成释放的意义

IL-6的生物学作用广泛，在免疫方面：IL-6能诱导B细胞增殖、分化和产生抗体，能促进T细胞在胸腺的生长与细胞毒性T细胞分化成熟，并诱导其活性发挥，刺激肝细胞产生急性期反应蛋白，引起发热；在血液方面：IL-6具有刺激机体血液生成系统，发挥造血作用；在神经系统方面：IL-6能对抗神经损伤，促进神经元的存活，促进和保护受损神经元及轴突的再生，诱导神经元分化，加强神经内Ca2+反应，调节神经递质合成，刺激星形细胞增殖，刺激丘脑下部一垂体一肾上腺皮质轴和诱导发热，并对疼痛进行调节。

由于PGE2在体内不稳定，远距离传递的过程中容易失去生物活性，故只能起到局部不同组织之间信息传递的作用和局部治疗的效应，因此它的治疗学意义可能小于它作为信号分子的意义，更多的是为腧穴其他特定组织诸多功能的启动营造一个适宜的局部生化环境。而IL-6不同，IL-6作为一种可以由力学刺激而诱导产生的生物活性蛋白，在体内，其生物活性相对稳定，既能作用于穴区局部，起到局部不同组织间的信号传递作用(自分泌和旁分泌作用方式)，又能通过某种途径作用于远端组织器官甚至全身(内分泌作用方式胡)，发挥远治效应，所以IL-6的治疗学意义同样巨大。如果IL-6作用于局部与远端的神经组织，发挥神经营养作用，对抗神经损伤，调节神经感受功能等，笔者认为这些生理作用的发挥，也许就是为什么针推治疗能够治疗多种神经系统方面疾病的潜在机制之一；另外，IL-6的免疫增强作用和刺激造血作用似乎也正体现了腧穴筋膜组织在机械力刺激下发挥“蠲邪扶正”治疗效应的现代医学生物学原理。