微生物多样性研究(6篇)

微生物多样性研究篇1

关键词：荧光原位杂交技术；环境微生物学；应用和进展

中图分类号：Q93-33文献标识码：A文章编号：1006-3315（2013）07-135-001

近些年来，随着分子生物学技术的不断发展，使得微生物学领域的研究发生了很大的变革，借助分子生物学方法来进行微生物的鉴定和检测成为了现代微生物诊断以及生态学研究的重要手段。FISH技术是一种将分子生物学精确性、显微镜可视性的特点进行结合的技术，它也可以对微生物群落来进行评价。现在FISH技术已经被很广泛的应用于环境微生物学中了，主要用于揭示微生物原位生理学功能和特性。

一、荧光原位杂交技术概述

（一）原理

荧光原位杂交技术是将核糖体内中高度保守、长度适中的16SrRNA序列来作为理想的基因分类靶序列，然后根据这个序列的特异性、保守性来设计所需的不同级别和分类的寡核苷酸探针，并且对特意核苷酸序列中带标记的RNA或者DNA分子进行识别，这个探针和待检测的靶DNA是同源互补的，经过变性、退火、复性的过程来形成核酸探针和靶DNA的杂交体。这种技术所使用的寡核苷酸探针是经过了荧光标记的约为20bp的特异性核苷酸片段，并利用这报告分子和荧光素标记具有的特意亲和素间的免疫化学反应，通过荧光检测系统来对要被检测的DNA进行定位、定性和定量的分析。

（二）特点

作为一种非放射性的检测系统，FISH技术有其特有的属性和优点：

1.FISH是一种非放射性的检测系统，采用的是生物素标记探针，避免了辐射性污染；

2.荧光探针具有稳定性和经济性，每进行一次标记就可以在两年之内进行使用，并且在一般的具有荧光显微镜的实验室都可以进行使用；

3.FISH技术基于抗原鉴特异性识别和结合的特点，具有特异性好、定位准确、实验周期短以及灵敏度强等优点，并且进行长度为1kbDNA序列的定位时，其灵敏度是和放射性探针不相上下的；

4.多色的FISH可以同时进行多种DNA序列的检测，可以应用的范围是十分广泛的。

（三）步骤

荧光原位杂交技术的操作步骤主要有七项，即1.样品固定；2.样品预处理；3.样品预杂交；4.样品和探针变性；5.杂交；6.漂洗去除没有结合的探针；7.对杂交信号进行检测。

二、荧光原位杂交在环境微生物学中的应用

（一）对环境微生物多样性的诊断

FISH对于环境微生物多样性的诊断是其在环境微生物学中比较具有代表性的应用。环境微生物研究方式主要是纯培养，但是环境微生物种类众多，只有很小的一部分能够被培养，所以这种方式会使其多样性分析产生的结果具有局限性，有研究人员发现在不同的环境微生物研究中99%以上的微生物种类是不能够被培养的。荧光原位杂交技术能够将微生物环境中的完整细胞景象信息进行再现还愿，精确度较高，因此在现在的微生物多样性的研究领域中被广泛的应用。FISH技术在近几年中，对于自然环境微生物群落的研究成果比较明显，有对海水沉积物群落的研究结果，也有海水、河水、高山湖雪水中的浮游菌体、根系表面以及土壤之中的寄居群落。荧光原位杂交技术不仅可以提供微生物在某一时刻的景象信息，还能够检测生物环境中微生物群落以及其种群动态。与此同时，FISH技术还被应用于鉴定和检测没有培养出来的种属和新种属，例如酸杆菌属、巨大硫酸盐细菌、全噬菌属等。这项技术已经成为探究自然菌群生态学组成和群落对于自然、人为因素的动态变化的答应研究最有利的一种科技手段了。

（二）对硝化细菌的研究

氨氧化菌和硝化菌的数量以及其空间分布式和微生物在硝化、反硝化的过程中所处阶段是相关联的，由此可见，对于生物处理系统中的硝化菌、氨氧化菌进行的研究是调控废水脱氮工艺想要正常运行的重要参数。传统的研究方式步骤过多，有分离、富集、分类、鉴定等，会耗费很多时间，这主要是因为硝化细菌在生理上是一种十分特殊的化能自氧菌。FISH技术能够解决这类问题，在很早之前就有研究者将这一技术引入到了硝化细菌检测中，建立起了一套比较完善的硝化细菌的FISH检测法。随着时展和科技的进步，人工设计合成的硝化细菌、氨氧化菌探针不断地被研究出来，FISH技术被越来越广泛地应用到了活性污泥系统以及消化流化床反应器、膜生物反应器等的污水处理系统中去了。

综上所述，荧光原位杂交在环境微生物学中的应用是十分广泛的，这项技术对于微生物种类多样性的研究以及处理三废都有很重要的意义。但是，FISH技术在应用中仍存在一些问题，随着研究的不断深入和不断完善，这些问题必将被解决，荧光原位杂交技术对于环境微生物学一定会有更加重大的理论和现实意义。

参考文献：

微生物多样性研究篇2

如果有人向你提出这个奇怪的问题，你也许会不假思索地回答：人类就是人呀！然而生物学家会告诉你，我们人类，就是人与寄存在人体躯壳内的大量微生物共生的一个小小的生态系统。

通过基因测序研究人体微生物

早在300多年前，显微镜被发明后不久，科学家已观察到人体内存在微生物。然而，由于检测、分析技术等的限制，人们无法大规模地获取人体微生物群的构成、功能等详细信息，更无法进一步了解这些数量庞大的微生物群与人体是如何相互作用的。

从人类基因组的破译开始，人们才真正对这些微生物有了比较深入的了解。2000年6月26日，当美国总统克林顿与英国首相布莱尔共同宣布人类基因组计划工作草图完成时，整个世界都为之轰动。围绕着破译“生命密码”的研究，引起公众的广泛关注和讨论。很多人曾认为，只要读懂人类基因组代表的“生命密码”，人类的所有健康问题将会迎刃而解。然而，越来越多的科学家发现，人体除受自身基因的调控外，还受到人身上大量的共生细菌的影响。

2007年底，美国国立卫生研究院正式启动为期5年的“人类微生物组计划”，共投入经费1.4亿美元。该计划是继“人类基因组计划”完成之后一项规模更大的DNA测序计划，也被称为“人类第二基因组计划”。其目标是探索研究人类微生物组的可行性。通过绘制人体不同器官中微生物元基因组图谱（包括细菌、病毒等微生物），解析微生物群结构变化对人类健康的影响。同时，为其他科学研究提供信息和技术支持。我国作为参与者也一直积极推动初期研究工作。

欧盟也有类似的研究项目，例如，作为人类元基因组第七框架项目的子项目，人类肠道宏基因组计划就主要研究人类肠道中的所有微生物群落，进而了解人肠道中细菌的物种分布，最终为后续研究肠道微生物与人的肥胖、肠炎等疾病的关系提供非常重要的理论依据。中国深圳华大基因研究院承担了该计划中的200多个欧洲人肠道微生物样品的测序及后续生物信息分析工作。

这一系列研究项目正在揭开人体微生物神秘的面纱。例如，研究发现肠道菌群结构的改变与失衡除了会导致肠道疾病外，还与糖尿病、肥胖等很多慢性全身性代谢性疾病有密切关系，甚至还与癌症有关。微生物甚至还影响着机体免疫系统的发育成熟。越来越多的研究提示，人类健康与人体微生物息息相关，随着人体与微生物之间的关系不断得到阐明，人们对于人体本身的认识、对于健康和疾病的认识以及医疗模式都有可能随之发生根本的改变。

研究发现微生物与人体健康息息相关

2010年3月4日，欧盟于2008年1月1日启动的人类肠道宏基因组计划的研究小组公布阶段性重大成果，引起世界的关注。该项研究成果收集了124个来自于欧洲人肠道菌群的样本，采用了新一代大规模高通量的测序技术进行深度测序，产出近6千亿的碱基序列。经过序列组装和基因注释分析，从中获得330万个非冗余的人体肠道宏基因组的参考基因，大概是人自身基因的150倍。这个基因集中包含了绝大部分目前已知的人体肠道微生物基因，但更多的是目前未知微生物的基因。从这个基因集中可以估计人肠道中存在1000种至1150种细菌，平均每个人体内含有约160种优势菌种，并且这些细菌是绝大部分个体所共有的。也就是说，我们每个活着的人体内都有大约100万亿个微生物细胞，总重量约1.5千克。微生物细胞的数量是人体细胞的10倍，在人体的独特基因中占99.9%。它们的构成在很大程度上决定着人体的运转以及机能正常或失常。

美国人类微生物组计划在2012年集中公布了第一批研究数据，来自多个国家的超过200名科研人员报道了他们5年来的研究成果。他们分析了242个美国健康志愿者微生物基因组，获得了近800个菌种的基因参考序列。他们发现，来自牙齿和粪便的微生物样本其类型和遗传多样性是最强的;来自皮肤和脸颊内侧样本的多样性次之;而来自阴道样本的多样性是最低的。

科学家们还发现，不同国家人群中的肠道微生物存在很多差异，差异最显著的是微生物的多样性程度。例如，印第安人和马拉维人的肠道微生物组比美国人的肠道微生物具有更大的多样性。有观点认为，微生物多样性程度越高，人体越健康。该研究还发现，尽管来自三种不同地域人群的肠道微生物组存在很多差异，但它们之间也存在惊人的相似性。例如，三个不同国家的婴儿微生物组形成过程具有共同的模式，即婴儿需要6个月至9个月的时间来获得第一组600～700个细菌，然后再经过几年的时间才能获得成人的微生物组。该研究还发现了一个非常有趣的现象，即肠道微生物组的构成会随年龄增长而发生改变，而这一变化恰恰适应了不同年龄段人体的需求。

同时，人体微生物还与免疫系统有着密切的关系。2012年4月，日本科学家在《科学》报告，发现一种免疫抑制性受体控制着肠道菌群的构成，如果这种受体缺失，肠道内的微生态环境就会紊乱，会导致全身免疫系统过度活跃，进而有可能出现自身免疫性疾病等病态变化。研究者认为，这些新发现有望帮助开发预防或缓解自身免疫性疾病症状的新方法。同期《科学》的另一项研究也提示，在生命早期接触微生物可以减少哮喘或炎症性肠病等疾病的发生。

人类肠道菌群与肥胖

随着科学家们研究的深入，我们对人类体内的微生物，尤其是肠道内的菌群，有了更多的了解。人类的消化系统实际上是一个复杂的生态系统，成百上千种细菌在那里开展各种活动，比如，让未消化的碳水化合物发酵、提供维生素，等等。它们还能调节你身体储存的脂肪量。

不过，并非每个人都有同样的肠道菌群。而且，有趣的是，菌群的组成与肥胖有关。当然，这种关系可能很简单，胖人的饮食不同，所以，他们的肠道菌群也不同。

2013年《科学》杂志发表的一项研究表明，这种因果关系也有可能颠倒过来。研究人员从一些双胞胎小鼠身上取出细菌，双胞胎中有一只肥胖，另外一只不胖。然后，他们将细菌移植到不同的小鼠身上。接受了肥胖双胞胎菌群的小鼠体重增加了，其他小鼠则不然。这些小鼠的进食没有增加：是它们的新陈代谢变化导致了体重增加，即使摄入的热量不变。

那么，是什么决定了你的肠道菌群呢？有可能是抗生素、环境毒素或食品的加工方式。《新英格兰医学杂志》上发表的一项研究表明，肥胖似乎能在社交网络中“传染”，让朋友和邻居感染上肥胖。我们以前一直认为，那是物以类聚、人以群分的结果―这也确实是部分原因。不过，会不会是肠道菌群也可以在非常亲密的人之间传播，所以，肥胖或许真的可以传染？

生物因素和行为因素之间往往存在相互作用，比如流感的传播就跟我们是否勤洗手关系巨大。同样地，这项对细菌的研究也发现，只有当小鼠的饮食中含有大量饱和脂肪时，“肥胖肠道菌群”才会起到作用。

最有趣的大概是，改变生物因素甚至可以改变人的欲求。一些生物学家推测，我们的肠道细菌其实驱动了我们对某些不健康食品的渴求。所以，重视生物因素并不等于淡化行为因素，而是意味着从更多的维度理解它。

我们身上的微生物正在发生变化

关于人类和与人类共存的微生物，正在发生一些值得我们忧虑的变化。就像全世界的生态系统一样，人类微生物菌群正在失去它们的多样性，以至于可能会损害它们所寄居的主体的健康。

纽约大学医学院传染病专家、人类微生物组计划负责人马丁・J・布拉泽博士在过去30多年间，一直研究细菌在疾病中发挥的作用。除传染病外，他的研究范围还囊括了自体免疫疾病，以及其他在世界范围内急剧增加的疾病。

布拉泽在他的新书《消失的微生物》中表示，微生物组多样性的减少导致我们更容易感染严重且通常都是慢性的疾病―从过敏、乳糜泻到一型糖尿病和肥胖症。布拉泽及其他人认为，这主要是由抗生素造成的。

布拉泽表示，抗生素很早就开始对微生物多样性产生破坏。普通的美国儿童在出生的头两年要接受大约3个疗程的抗生素，在接下来的8年里，要再进行8个疗程。很短疗程的抗生素治疗就能致使人体的微生物环境发生长期转变，比如，被广泛使用的阿奇霉素。

抗生素并不是破坏平衡的唯一因素。布拉泽接受采访时表示，近几十年，选择剖腹产的人激增，剖腹产促使婴儿内脏中的微生物来自母亲的皮肤，而不是产道。

微生物组的变化能够改变婴儿的新陈代谢和免疫系统。最近，研究人员查阅了15项共涉及16.3796万个分娩案例的研究，结果发现，与顺产的婴儿相比，剖腹产婴儿成人后超重的几率要高26%，肥胖的风险要高22%。研究人员发现，人的胎盘有自己的微生物组，这个微生物组可能也有助于婴儿的内脏健康，减少由剖腹产引发的微生物损耗。

其他研究发现了正常体重者与肥胖者肠道中微生物的主要差异。虽然这些研究不能说明最先出现的是那个问题―体重问题或微生物组的变化，但研究说明，肥胖的老鼠体内存在能够更好地从食物中吸取热量的肠道菌群。与肥胖相关的进一步证据来自农场里的动物。在美国出售的抗生素中，大约有3/4都用在牲畜身上。这些抗生素改变了动物的微生物菌群，加快了它们的生长速度。布拉泽说，当我们把用于牲畜的抗生素用在老鼠身上时，它们的新陈代谢就会发生改变，并促使它们的体脂增加。

更严重的是，如今有越来越多严重的功能失调都与人类内脏的微生物平衡被破坏有关。其中，有多种功能失调在发达国家中变得越来越常见，如克隆氏症、溃疡性结肠炎和乳糜泻胃肠疾病等;心血管疾病;非酒精性脂肪肝;慢性反流症等消化失调问题;多发性硬化和风湿性关节炎等自体免疫性疾病以及哮喘和过敏。

有些研究人员甚至推断，内脏微生物菌群失调是造成乳糜泻的原因，所以，甚至连没患这种病的人对无麸质食物的需求也会激增。乳糜泻旧称非热带脂肪泻，又称乳糜腹泻、麦胶引起的肠病（简称麦胶肠病）。乳糜泻是一种具有遗传性的发生于小肠的自身免疫性疾病，从婴儿到各年龄段的人都会罹患。乳糜泻的症状包括慢性腹泻，生长迟滞（儿童）和疲劳，但有些人症状不明显。在北美、北欧、澳大利亚发病率较高，我国国内很少见。

布拉泽和其他研究人员，还有来自瑞士和德国的一组研究人员也认为，哮喘患病率的大幅上升与“幽门螺杆菌从西方社会快速消失有关”。众所周知，幽门螺杆菌是一种长期寄存在人类胃里的细菌性病原体。曾几何时，几乎每个人体内都有这种细菌，欧洲研究者已经证明，它能防止老鼠出现过敏性哮喘的症状。在人生命的早期阶段，幽门螺杆菌的存在能促使血液中产生T细胞。布拉泽表示，压制过敏反应就需要这种细胞。他的研究表明，虽然有些类型的幽门螺杆菌与消化性溃疡和胃癌有关，但其他类型则具有保护作用。布拉泽和同事的研究进一步表明，胃部的幽门螺杆菌能够防止胃食管返流疾病、巴雷特氏食管（食管下端有不正常的柱状上皮覆盖，称之为巴雷特氏食管。普遍认为是后天获得的，并与反流性食管炎密切相关，并有发生腺癌的可能）和食道癌。

研究者不是总能说明肠道菌群紊乱会在人们生病之前还是之后出现。不过，对实验室动物的研究往往表明，菌群紊乱会发生在生病之前。

微生物多样性研究篇3

关键词：微流控芯片；基因芯片；芯片实验室；体育科研

中图分类号：G804文献标识码：B文章编号：1007―3612(2006)11―1495―03

1微流控芯片技术概述

1．1微流控芯片微型全分析系统又称为芯片实验室，是一个跨学科的新领域，是通过分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学及生物学、医学的交叉实现化学分析系统，从试样处理到检测的整体微型化、自动化、集成化与便携化。微流控分析芯片是微型全分析系统的主要组成部分，是以常规毛细管电泳原理为基础，通过微细加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件、窗口和连接器等功能元器件像集成电路一样，使它们集成在芯片材料(基片)上，实现样品进样、分离、反应乃至在片检测的微全分析系统。它以分析化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络微结构为特征，以生命科学为目前主要应用对象。

微流控芯片的早期形式是芯片毛细管电泳。根据芯片材料的不同可分为硅芯片、玻璃芯片、石英芯片、高聚物芯片和复合材料芯片；根据功能的不同可分为高分辨分离芯片、微采样芯片、微检测芯片、细胞分析芯片、前处理芯片、化学合成芯片、多功能集成化芯片。每一个芯片实验室都将被赋予一定的功能，因此形成功能芯片系统，大体包括三个部分：一是芯片；二是信号的检测收集装置；三是包含有实现芯片功能化方法和材料的试剂盒。所涉及到的部件包括：和进样及样品处理有关的透析、膜、固相萃取、净化；用于流体控制的微阀(包括主动阀和被动阀)、微泵(包括机械泵和非机械泵)；微混合器、微反应器、微通道和微检测器等。其制作工艺包括芯片的基体加工及表面加工、键合和粘接等。

微流控芯片把整个生化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在微芯片上，且可多次使用。因此具有广泛的适用性。微芯片分析系统的出现不仅可使珍贵的生物试样与试剂消耗大大降低到微升甚至纳升级，而且使分析速度成百倍地提高，费用也相应下降，从而为分析测试技术的普及创造了条件。近年来，微流控芯片技术在以下几方面得到了发展：微流控分析系统从以毛细管电泳分离为核心分析技术发展到液－液萃取、过滤、无膜扩散等多种分离手段，具有广泛的应用前景；微流控分析系统从单道检测发展到多重平行检测；微全分析系统从成分分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段；在新药物筛选中显示出强大的生命力；微流控分析系统具有多种检测手段，如电化学、质谱、原子光谱、光声光谱、化学发光等。由此可见，微流控芯片在生物化学分析中具有显著优势，这种生化检测可以提高分析速度，增加分析效率，减少样本和试剂的消耗，排除人为干扰，防止污染以及完成自动高效的重复实验。分析系统的微型化可以使野外实验室变得很简单，芯片实验室的潜在应用范围包括高效筛选、环境监测、临床监测、空间生物学、现场分析、生物战争试剂检测、高效DNA检测等。

1．2微流控芯片与基因芯片20世界90年代初由瑞士的Manz和Widmer提出了以微机电加工技术(microelectro－mechanicalsystems，MEMS)为基础的“微型全分析系统”(micrototalanalysissystems，μTAS)。μTAS可以分为芯片式与非芯片式两大类，其目的是通过化学分析设备的微型化与集成化，最大限度的把分析实验室的供能转移到便携式的分析设备中。目前，芯片式是发展的重点，即最大限度地把分析实验室的供能集成到方寸大小的芯片上，实现所谓的“芯片实验室”(lab-ona-chip，IDC)。在芯片式μTAS中，依据芯片结构及工作原理又可以分为微阵列芯片和微流控芯片。微阵列芯片目前的应用对象是DNA分析，也称DNA芯片、基因芯片或生物芯片。生物芯片技术的实施包含三个基本元素：1)生物探针分子的获得；2)探针分子的表面固定和对样品的识别；3)识别结果的检测和分析。有关基础研究始于20世纪80年代末，主要是在生物遗传学领域发展起来的。而微流控分析芯片是1990年提出的μTAS主要发展方向，主要是在分析化学领域发展起来的。在目前的学术刊物中，微全分析系统(μTAS)和微流控芯片(microfluidicchip)指的是同一个概念。其目标是把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等集成在可多次使用的微芯片上。因此较微阵列芯片应有更广泛的适用性及应用前景。

1．3微流控芯片的应用目前微流控芯片已突破其发展初期在加工技术即基本流控技术上的主要难关，正在进入一个开展更深入的基础研究、广泛扩大应用领域，及深度产业化的转折时期。这种微型化、集成化的微流控芯片氨基酸和蛋白质的分离、免疫分析、DNA分析和测序、生物细胞研究等方面显示出巨大的潜力。这必将对疾病诊断和治疗、新药开发、食品卫生等诸多领域产生革命性的影响。

1．3．1蛋白质分析微流控芯片的一个重要的应用领域是蛋白质。蛋白质的微流控电泳芯片，通过在玻璃片或硅片上设置各种微泵、微阀、微电泳以及微流路，可将生化实验室的分析功能浓缩固化在蛋白质芯片上，然后在电场作用下，样品中的蛋白质通过芯片上的孔道分离开来，经喷雾直接进入质谱仪中进行检测，以确定样品中蛋白质的分子量及种类。除了蛋白质以外，对更为复杂的糖蛋白的芯片测定也已开始，用电泳技术结合蛋白酶和糖苷酶对蛋白质的处理，在芯片实验室进行糖蛋白中糖链分析的方法已建立。徐良基等利用微流控芯片技术制作石英玻璃材料的微流控芯片，在自行研制的紫外可见吸收检测系统上，实现了芯片上对牛血清蛋白BSA、人免疫球蛋白IgG和人转铁蛋白TRF及它们的混合溶液的分离检测，结果重复性较好。王惠民等依据电荷和分子量的不同，利用微流控芯片技术，在2～3min内检测到38例尿蛋白阳性患者中，溢出性蛋白尿3例、选择性蛋白尿9例、非选择性蛋白尿26例，8例健康对照未检出蛋白峰。

1．3．2免疫分析免疫分析是利用抗原和抗体之间的特异性反应来选择性识别和测定作为抗体或抗原的待测物。经过多年的应用与发展，免疫分析已经成为临床诊断、生物医药以及环境化学研究中一种有力的分析手段。降低样品和试剂的消耗量，提高分析速度是免疫分析的重要目标。在微流控芯片上进行免疫分析是对毛细管电泳免疫分析技术的重大革新。这种微片装置是在微型的玻璃片或者硅芯片上采用化学刻蚀等技术产生一些微小的通道来代替传统的毛细管作为电

泳分析的场所。这种开放式的通道结构使得在很短的分析长度内就可以满足分析需求，可以大大缩短整个分析所需的时间，并可根据实际需要设计合适的芯片。芯片上可以很容易地刻蚀上很密集的分析通道的阵列，并可高精度地复制生产，大大增加了分析通量。因此，免疫分析在微流体系统中的应用已受到广泛的关注。

1．3．3DNA分析及测序微流控芯片可用于迅速分离DNA限制性片段PCR产物，比常规的毛细管电泳分离要快得多。把β珠蛋白的PCR扩增反应缩微集成到硅芯片上，目的基因进行15min的扩增，然后仅用2min就可完成PCR产物的分离，整个分析过程不到20min。混合样品多PCR产物电泳芯片分离，可同时分析10个以上PCR反应产物，尤其适用于基因作图分析，以及遗传性疾病诊断。在微流控芯片上观察荧光标记DNA的重复三联体序列，分离速度是常规毛细管电泳的十几倍。此外，常规DNA测序需要制备微升级的样品，试剂消耗量大。将纳升级的样品制备系统缩微到芯片上进行测序，可在分离前除去多余的引物、盐分、核苷酸等，所用测序体积是Sanger双脱氧链终止法的1／300，测序成本明显降低，而且可进行固相测序。将微流控芯片四色标记法用于DNA测序，可在540s分离150个碱基，准确率在97％以上。用高分子材料制作的微流控－微阵列芯片，可以用于核酸杂交并对其进行实时检测。而且微流控－微阵列体系还可以检测杂交反应的动力学特性。

1．3．4细胞培养与检测单细胞分析对重大疾病的早期诊断、治疗和药物筛选以及细胞生理、病理过程的研究有重要意义。微流控分析芯片的网络结构和微米级的通道尺寸使简化单细胞分析成为可能。微流控芯片系统用于细胞分析是近年来该技术发展的一个热点，已引起较广泛的关注。利用微全分析系统高度微型化、集成化和设计灵活等特点，通过巧妙设计和精密加工能够实现细胞的培养、凋亡及检测等功能，如细胞操作，绿色荧光蛋白的表达，基因转染，细胞活性测试，细胞分离，细胞内钙离子的测量，激素分泌监测以及高通量的细胞含量分析等。目前，微流控：片系统已被应用在血液流变学、单细胞操纵与计数以及单细胞胞内组分分析等多方面。在微流控芯片通道中，人们利用气压、液压和电压，或利用介电电泳、光学陷阱、行波介电电泳以及磁场等技术，可以操纵细胞通过或驻留在通道内的任意位置，从而使单细胞计数、筛选以及胞内组分分析等操作大大简化。

1．3．5药物筛选药物筛选是现阶段新药开发的主要途径。高通量药物筛选是近10年来发展起来的药物筛选的新的技术体系。微流控芯片实验室实现药物筛选的基本原理是以酶标为例，即令酶和一种荧光标记的底物反应，使之产生一种荧光产物，用芯片电泳将这一荧光产物和荧光底物或其他荧光本底分离开来。这种方法已经用于蛋白激酶．磷酸酶、蛋白酶、细胞色素和磷酸单脂酶等，芯片上的分离只需几秒，通常变异系数小于10％。用于药物筛选微流控芯片装置有两大类，一类是一次性使用芯片，它采用类似于喷墨打印机的微散射法，把样品和试剂注入芯片的一组通道；另一种以连续流法为基础，它将样品的注射过程、混合过程和功能实现过程在芯片上集成于一体。

微流控装置的用途广泛，但目前流行的微流控装置最大的不足之处是它们需要大量辅助的外部设备，体积庞大且成本很高，这就极大地限制了它的应用。克服这些困难的一个途径就是将所需试剂装配并存储于微流控体系内部，真正实现“lab-on-a-chip”。有学者预计，最晚到2008年，以微流控芯片为核心的微分析系统将取代当前化学分析实验室的很多设备，使化学分析进入病房、生产现场甚至家庭。在此基础上再经过三五年，能监测自身生化指标及基因变异、食品卫生及环境状况的便携式“个人化实验室”将可能成为现实。

2微流控芯片技术与体育科技研究

中国自1984年重返奥运大家庭以来，在奥运会上取得了喜人的成绩。这些成绩的取得与科研人员参与到运动队中开展科研攻关与科技服务，大大提升科学化训练的水平密切相关。在总结了以往开展科研攻关与科技服务经验的基础上，针对运动员在训练比赛中遇到具有共性和基础性的问题，在新的一个备战奥运会周期中，提出了10个领域的科研工作，即运动员科学选材、运动训练科学化理论与方法的研究与应用、优秀运动员训练监控和机能评定的研究与应用、运动员体能恢复与营养补充的研究及应用、运动员心理咨询和心理训练理论与方法的研究及应用、运动创伤与医务监督的研究与应用、中医药防治运动性疲劳及伤病的研究与应用、反兴奋剂的研究与应用、体育信息与服务的研究与应用、竞技体育综合管理及战略研究。其中，在运动人体科学领域涉及的主要的热点问题有，运动损伤的防治、运动性低血睾酮、运动性低血色素(运动性贫血)、运动性免疫机能低下等的发生机理的研究，以及兴奋剂检测方法的研究，等等。

随着教练员、运动员文化素质的提高和运动训练基地科研条件的改善，借助科技手段辅助训练日益被教练员、运动员所接受，甚至有些教练员已经开始尝试根据科研人员的科学检测报告制订训练计划。事实上，对训练进行科学监控已成为当今运动训练(科学)的重要组成部分。目前，常用辅助教练员开展训练、评价运动员体能的指标有，血睾酮、皮质醇、血乳酸、血红蛋白、红细胞谷胱甘肽和活性氧、血清肌酸激酶、血尿素、IgN、IgA、IgG等，其中，监测血睾酮、皮质醇、红细胞谷胱甘肽和活性氧等通常须要采集受试者的静脉血，用分离出的血清与红细胞才能完成监测。然而，运动员和教练员往往不愿接受静脉取血，因此，研发微创、微量(采集末梢血)、快速的分析方法检测生化指标，现场化、及时性地评价运动员体能具有重要的意义，相关方法的研究亟待解决。

根据微流控芯片实验室所需样品微量，更具高通量、高效率、短时间等优势，中国科学院林秉承等与我们合作，利用微流控芯片技术进行了血睾酮和皮质醇联合检测芯片，血睾酮、皮质醇联合检测芯片分析仪的研发，目前该工作已完成标准品的检测。如果能够充分发挥微流控芯片技术的优势，研发出不需要用常规的静脉取血分离血清检测的方法，而是以末梢微量全血为直接的检测样品的芯片检测系统，建立通过微量的末梢血就可以快速、准确地完成多项指标的同时检测的运动员体能监控的微创检测方法，那么这将是一个“质”的飞跃。这个飞跃不仅仅会体现在检测方法上，也一定会体现在提高运动员体能上。如果能将这种技术推广应用，必将受到体育科技人员、乃至运动员和教练员的普遍欢迎，具有广阔的市场前景。

另外，利用微流控芯片电泳同时检测细胞活性氧类和谷胱甘肽的技术、单分子光学检测技术、基于毛细管及芯片电泳的分子相互相互作用的研究技术和基因诊断技术引等皆有可能作为研究方法，应用到体育科研中。

微生物多样性研究篇4

根际土壤中存在大量的宏观生物和微生物,如细菌、真菌、原生动物和藻类生物等,细菌是该群体中数量最多的一类微生物。微生物和植物在根际环境中形成的复杂网络式关系会直接和间接地影响植物生长;反过来,植物通过分泌有机物,构建起一个有选择性的环境条件,以利于对其生长有益的细菌,导致根际细菌多样性偏低[4,5]。植物根际促生菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR)在根际微生物群体中研究最为热门,也是对农业生产最具有应用价值的一类微生物。由于PGPR数量众多,且在根际定殖时具有竞争力,加之其作用机制的多样性,因此能在很大程度上影响植物生长。然而,人们在使用PGPR或相关制剂时,普遍发现大田应用效果远不及盆栽或温室条件下的效果理想,主要原因是PGPR对“陌生”环境的不适应。根际微生物是野外环境中的主要“陌生”因素,因此,了解与某些基本生态过程,如复杂性、自然选择、种间关系(共生、寄生、共栖和竞争)、演替或扰动效应有密切关系的根际微生物群落结构和多样性,可以帮助人们更好地理解根际生态系统,并为PGPR的筛选和高效利用提供理论依据。基于此,本文主要从根际微生物群落多样性、PGPR生态和遗传多样性以及PGPR的筛选策略等3个方面进行综述。

1根际微生物群落多样性

微生物多样性包括物种、遗传与变异以及功能多样性[6]。在根际系统中,细菌群落的功能多样性是基于其遗传变异以及和其他原核、真核生物(如植物)的互作关系。直至现在,根际微生物多样性与根际微生物功能之间的关系仍不十分清楚。根际微生物多样性信息的缺乏,其原因一是其种类繁多,二是绝大多数微生物的不可培养性。

1.1根际微生物群落结构的研究方法

研究微生物群落结构,就必须了解各类群微生物群体的种类及数量。传统技术是通过从根际土壤中提取、分离微生物,实验室条件下对其进行形态学、生化和遗传学检验。由于细菌往往和土壤基质以及其他细胞紧密附着,因此在细菌提取中常用到分散剂,即用物理或化学方法将细胞和基质区分开,之后才能对分离细菌生物量进行测定。

微生物生物量的测定常用方法有:显微镜下直接计数(如吖啶橙染料染色)[7]、微生物呼吸量测定(如基质诱导呼吸量,Substrateinducedrespiration,SIR)[8]、ATP含量测定[9]、最大或然法(Mostprobablenumber,MPN)计数[10],使用脂类生物标志物[11]以及氯仿土壤熏蒸法[12]等。但是,土壤中可培养微生物比例毕竟极低。有研究者曾估算这一比例只有不足1.0%(0.2%~0.8%)[13]。正因为如此,基于平板培养法研究土壤微生物多样性存在重大缺陷,免培养技术顺应而生。所涉及的技术包括磷脂脂肪酸(Phospholipidfattyacidanalysis,PLFA)分析法[14-16]、DNA/RNA杂交[17]、聚合酶链反应(Polymerasechainreaction,PCR)、核糖体RNA测序[18]、(G+C)含量[19]、温度梯度凝胶电泳(Temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)和变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)、限制片段长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)[20,21]、DNA微阵列(DNAmicroarray)[22]技术(又称“DNA阵列”或“DNA芯片”)、克隆文库分析等方法。过去20多年间,人们利用这些技术手段揭示了很多有关土壤微生物群落的信息[23]。这些方法各有优缺点,正确选择合适的方法进行研究,有助于更准确地了解根际土壤微生物群落结构特征。

1.2根际微生物活性和功能多样性的研究方法及根际PGPR活性

研究根际微生物活性的经典方法,是将细菌进行培养、分离并作理化试验。另一个方法是利用细菌在不同培养基上的生长速率来表征该菌在环境中的生理特性、养分利用特点和自适应策略[24]。

目前,人们广泛采用某一关键酶活性的测定来表征某类群微生物的多样性和代谢活性。此外,Biolog体系也是应用较为广泛的方法之一[16,25]。另外,通过克隆构建大片段DNA文库(如BAClibrary),有助于更准确地揭示土壤中可培养和不可培养微生物,以及土壤微生物生态系统的相关信息[22]。未来土壤微生物群落结构的研究无疑会大量运用DNA微阵列技术[22],因为该技术可以利用其高特异性特点,将不同活性微生物区分开,并有助于解释同一菌株在不同环境土壤样本中的生态位的异同。当然,基因转录、蛋白质组学等技术也是未来微生物学研究中不可或缺的辅助手段[22,26]。

根际微生物多样性反映了微生物群落的代谢活跃程度。在土壤中接种PGPR,只要能存活,无论是否改变微生物群落结构,都会在一定程度上影响群落的代谢活性[15]。因此,接种PGPR是否能在土壤中存活并竞争是一个十分关键的问题,受物理的(质地、温度和湿度等)、化学的(pH、养分的可利用性、有机质含量等)以及和根际其他微生物之间的互作关系等因素的影响。其中,PGPR与根际土着微生物的互作关系是一个十分重要的影响因子,因为接种PGPR需要在根际形成新的生态位,并在根际定殖,且能竞争足够的养分。总之,接种PGPR后,要能以有限的群体发挥应有的生物效应。

目前,人们可借助多种技术研究根际土壤微生物活性,比如前面介绍过的同位素(3H、14C)标记DNA的胸腺嘧啶核苷或蛋白质的亮氨酸组分,来估算群落代谢活性和生长状况[7,27]。此外,还可以用SIR技术定量测定根际微生物活性[8]。

2PGPR生态及遗传多样性

近些年来,由于人们愈加深刻地认识到根际生态系统的重要性,加之PGPR作用机制研究的不断深入[28],越来越多的PGPR被筛选出来并加以鉴定。从结果看,很多属都有PGPR的分布。下面以目前PGPR相对集中的几个属来阐述其生态特征和多样性。

2.1固氮PGPR(DiazotrophicPGPR)

自生固氮菌大概是首个被发现具有促生作用的根际微生物。自20世纪70年代,固氮螺菌属(Azospirillumsp.)的菌株就已被分离出并应用于实践[29]。其他还有能起促生作用且能自生固氮的属种主要有固氮弓菌属(Azoarcus,Azonexus,Azospira)[30]、布克氏菌属(Burkholderiasp.)、重氮营养葡糖酸醋杆菌(GluconaCETobacterdiazotrophicus)、草螺菌属(Herbaspirillumsp.)、固氮菌属(Azotobactersp.)和多黏类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)等[31]。上述这些细菌可以从许多种类植物,包括水稻、甘蔗、玉米、高粱以及其他谷物,甚至菠萝、咖啡豆的根际分离到。

最近,固氮弓菌因其遗传和代谢多样性而逐步引起研究者的关注。该属细菌能生长在以羧酸类或乙醇为碳源的培养基上,而且最适生长温度在37~42℃。

2.2杆菌(Bacillus)

土壤中的G+杆菌有95%属于芽孢杆菌属(Bacillussp.),其余5%属于节杆菌(Arthrobacter)和弗兰克氏菌(Frankia)[32]。许多杆菌能在逆境下形成芽孢以增强生存能力,一些杆菌如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)还具有固氮能力[33]。杆菌类的PGPR具备多种促生能力[14,34,35]。

2.3假单胞菌(Pseudomonas)

在植物根际土壤G-细菌中,假单胞菌是数量最多的一类,该属中的PGPR也因为促生能力广泛而被人们所熟知[14,36,37]。假单胞菌属细菌生态多样性丰富,国内外已经从许多植物根际土壤中分离出大量该属的细菌。假单胞菌细菌往往代谢功能多样,可以产生抗生素、嗜铁素或氰类化合物等多种代谢物[38]。这些代谢物通过抑制其他有害微生物以及帮助植物吸收土壤养分,从而影响根际生态环境。

2.4根瘤菌(Rhizobia)

这里提及的根瘤菌是指能在非豆科植物根际进行非特异性定殖,并释放促生调控因子,如嗜铁素、氰类化合物或进行溶磷等作用,提高土壤养分的可利用性[39]。已有报道指出,在作物和一些非豆科植物轮作后,其根际微生物数量会大幅增加[40],这对随后的作物生长十分有益[41]。

3PGPR筛选策略

微生物多样性研究篇5

关键词极端微生物；极端环境；适应机理；应用

中图分类号Q939.9文献标识码A文章编号1007-5739（2014）09-0249-02

ResearchProgressofAdaptationMechanismandApplicationofExtremeMicrobesTowardExtremeEnvironment

MENGSu-xiang1CAOJian1，2*

（1SchoolofBioengineering，HenanUniversityofTechnology，ZhengzhouHenan450001；2ZhongyuanUniversityofTechnology）

AbstractExtrememicrobesgrowintheextremeenvironments，sotheymustownspecialcellstructure，physiologicalmechanismandgeneetc.Inthispaper，thelateststudiesonthesurvivalmechanism，classificationandapplicationofsixkindsofextrememicrobeswerereviewed，whichcanprovidesometheoreticalbasisforutilizationandmetabolitesexploitationofextrememicrobesstrainsresource.

Keywordsextrememicrobes；extremeenvironment；adaptationmechanism；application

极端微生物是指生长在极端环境下，并依赖这些极端环境中的一种或几种极端因子生长的微生物的总称，包括嗜热、嗜冷、嗜盐、嗜酸、嗜碱、嗜压等多种类型的微生物。极端微生物是有着巨大应用价值的宝贵资源，这些微生物是生物圈的边界生命，近年来，对极端微生物的研究得到高度重视，特别是极端微生物应用方面，其代谢产物和菌体本身在生产生活方面的应用给人们带来了极大的利益。不仅在揭示生命起源、探索生命进化理论、生物多样性等方面带给研究者重要的启示和拓展，而且在环境保护、石油开采、能源利用、燃料乙醇生产，甚至人们的日常生活中都有广泛的应用。

1嗜热微生物

嗜热菌是指生活在高温废水、热泉、火山等高温地带的一类微生物，根据最适温度的不同，分为极端嗜热菌（最适温度65℃以上）、专性嗜热菌（最适温度40℃以上）和兼性嗜热菌。嗜热微生物基本上都是真细菌和古细菌，已鉴定出的嗜热微生物有140种，分布于将近70属中[1]。

1.1嗜热机理

嗜热微生物能够在高温条件下生长繁殖，必然有其独特的生存机制[2]，其细胞膜组成、嗜热蛋白质和嗜热酶、遗传物质结构的稳定性等都与常温微生物不同，概括起来主要有：细胞膜中长链饱和脂肪酸比例高，疏水键强度大，耐高温水平提高；蛋白质一级结构氨基酸的组成和排列不同，一些金属离子如Ca2+、Mg2+、Zn2+对蛋白质的空间结构起稳定作用，使蛋白质在高温条件下具有稳定性；遗传物质，包括DNA和tRNA中G、C碱基含量都很高，使堆积力增大，不易解链，并且tRNA的周转率高，可保证一些重要酶的快速合成。

1.2嗜热菌的应用研究进展

嗜热菌是极端微生物中应用最广泛的一类微生物，国外进行了大量研究，嗜热菌中的嗜热酶更是被广泛开发利用。海藻糖是糖类中唯一对生物体具有神奇保护作用的一种糖，海栖热袍菌的海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达，使得高温酶解法制备海藻糖成为现实[3]。葡糖醛酸酯酶是一种可降解植物细胞壁的新型酶制剂，将Sporotrichumthermophile的葡糖醛酸酯酶基因克隆到Pichiapastoris，表达后第1次得到嗜热葡糖醛酸酯酶[4]。在墨西哥油田，岩心驱替实验利用嗜热微生物、发酵微生物和厌氧微生物对常规技术提取后的重油进行恢复，具有明显的效果，恢复率达到19.8%[5]。利用地衣嗜热微生物Circinariagyrosa模拟火星条件下极端微生物的生存能力，以评价地球外的可生存环境，作用120h后，其光合作用不变，证明该嗜热菌具有很强的生存适应能力[6]。

2嗜冷微生物

目前已知将近75%的地球生物圈基本属于低温环境，包括深海、极地、岩洞、高山和人工冷环境。根据最适温度的不同，将嗜冷微生物分为嗜冷菌（最适温度15℃）。已发现的嗜冷微生物有细菌、蓝细菌、真菌及嗜冷古生菌，绝大多数嗜冷微生物为革兰氏阴性菌。

2.1嗜冷机理

低温条件下细胞膜的流动性较差，嗜冷微生物可通过改变细胞膜的组成（含有大量分支脂肪酸或短链和不饱和分支脂肪酸）来保持其流动性，并且脂肪酸的含量还随着温度的变化而变化。嗜冷微生物可产生多种嗜冷同工酶，酶组成中中性氨基酸含量增加，使其在低温条件下仍能保持酶活性。低温条件刺激具有感知温度能力的冷休克基因mRNA正常表达，产生大量冷休克蛋白，而冷休克蛋白可能是嗜冷微生物嗜冷的关键因素。tRNA在转录时结合的二尿嘧啶比例提高，以保持低温条件下的流动性[7]。

2.2嗜冷菌的应用研究进展

2002年，美国首次完成了对1株北极耐冷菌的全基因测序工作。Allenetal[8]分离得到的伯顿拟甲烷球菌，是第1个被正式鉴定的嗜冷微生物。Steinbergetal[9]应用分子生物技术如定量PCR、16SrRNA、FISH、功能基因克隆文库（clonelibrary）等研究嗜冷甲烷菌，进而分析微生物多样性及群落的动态变化。

利用嗜冷产甲烷菌生产沼气，对于解决低温条件下北方用户利用沼气越冬具有重要意义。嗜冷微生物产生的冷适应酶具有高级别的立体特异性，能够消耗极少的热源使反应发生，从而降低成本，如β-葡糖苷酶、果糖二磷酸醛缩酶、琼脂糖酶等[10]。日本研究人员从寒冷土壤和水中分离出能产生冷适应酶的Pseudomonassp.PL-4，在北海附近，挪威ASA公司建立了用于分离冷适应酶的研究基地。倪永清等[11]通过对天山一号冰川底部产高效冷适应酶的嗜冷菌进行分离筛选，从125株菌中筛选到27株产蛋白酶的耐低温菌株，其中21株为适冷菌，专性嗜冷菌有6株，大部分是革兰氏阴性菌，且40.7%为假单胞菌属（Pseudomonas）菌株，为嗜冷微生物种群的生物地理学研究提供了依据。

3嗜盐微生物

嗜盐菌是指生活在盐浓度大于0.2mol/L环境中的微生物，如死海、犹他大盐湖或人工腌制食品等环境中。根据最适盐浓度的不同，分为耐盐菌和嗜盐菌，耐盐菌又包括轻度嗜盐菌和中度嗜盐菌。海洋微生物大多为轻度嗜盐菌，中度嗜盐菌中真菌比例较大。嗜盐菌大多数是古细菌，并依赖于高盐环境，有的甚至能在饱和NaCl（5.5mol/L）中生长。

3.1嗜盐机理

赵婉雨等[12]在达布逊盐湖发现的主要嗜盐菌菌群拟杆菌门，和嗜盐古菌一样能够合成细菌视紫红质，以光驱质子泵的方式产生能量；另一菌群鞘脂杆菌在高盐环境下合成的鞘脂同样对细胞具有保护作用。还有一些研究表明，嗜盐菌细胞内含有大量的氨基酸、四氢嘧啶、甘油等相溶性溶质以维持细胞渗透压，而嗜盐酶中酸性氨基酸比例高，表面呈负电荷，以增加其稳定性。

3.2嗜盐菌的应用研究进展

筛选嗜盐微生物对于提高酱腌菜的产品质量具有重要的实际应用价值。曲玲童等[13]从锦州腌渍小黄瓜中筛选到嗜盐微生物，并对该菌的发酵特性进行研究，在含7%NaCl的MRS培养基中32℃发酵培养20h后，其产酸能力提高16.78%，产酸率为1.60%。在酱油工业中嗜盐蛋白酶发挥着举足轻重的作用。王栋等[14]对高盐酱油发酵过程中米曲霉CICIMF0899产耐盐蛋白酶的作用进行了研究，与沪酿3042相比，发酵180d时氨基酸态氮含量达0.62g/100mL，比沪酿3042高11.11%。

四氢嘧啶是一种相溶性物质，在青海湖中利用高效液相色谱技术获得5株具有四氢嘧啶高产潜力的野生菌株，其中中度嗜盐菌QHL5产四氢嘧啶最高产量达到325.47μg/mL[15]，为相溶性物质的开发利用提供了依据。

利用嗜盐菌与新型生物工艺相结合处理高盐废水，是目前国内外高盐废水处理领域的一个重要研究方向，杨静等[16]利用生物法处理高盐废水，通过添加嗜盐菌使微生物组成发生改变，进而使主体活性污泥的活性增加，使SBR法处理废水的效果显著增强。

4嗜酸微生物

嗜酸菌指最适生长pH值为1.0～2.5，最适pH值上限为3的一类微生物。极端嗜酸菌多分布于废煤堆、金属硫矿床、生物滤沥堆及酸性温泉中。研究表明，在某些酸性环境中真核生物比原核生物具有更高的多样性，其中嗜酸真菌包括嗜酸酵母、丝状真菌及少数藻类。

4.1嗜酸机理

嗜酸微生物的细胞膜是抵御外界酸性环境的重要保护伞，在酸性条件下，质膜上的脂质四聚体使质子几乎无法通过。脂质体囊泡结构在酸性条件下渗透H+离子，聚集在膜上的金属离子也可以和H+进行交换，以保持细胞内的中性环境。另外，跨膜电位差的迅速变化以及H+离子的扩散作用也有利于嗜酸微生物的生存[17]。

4.2嗜酸菌的应用研究进展

嗜酸微生物的应用主要是其产生的嗜酸酶。Guazzaronietal[18]建立了现代分析方法宏基因组学克隆新的嗜酸基因，为新的嗜酸酶的发现提供了新思路。

纤维素酶是利用可再生资源纤维素的关键酶，利用嗜酸纤维素酶制备燃料乙醇具有独特的优势，Wuetal[19]在嗜酸纤维素酶热稳定性改良方面取得重大突破。嗜酸淀粉酶如今在各个行业都有广泛的应用，Schwermannetal[20]在pH值小于4.6的条件下，从酸热脂环酸杆菌中克隆α-淀粉酶基因，并于大肠杆菌中表达，表达产物酶活性达到50%，这是目前人们了解最多的嗜热嗜酸淀粉酶。

5嗜碱微生物

嗜碱菌是指最适生长pH值在9.0以上的一类微生物，分为专性嗜碱菌和耐碱菌。嗜碱微生物包括细菌、真菌和古生菌。嗜碱菌常生存在天然碳酸盐湖、碱性湖、热泉、造纸及食品加工造成的碱性废水、废渣环境中。

5.1嗜碱机理

嗜碱微生物的某些基因与耐碱性有关。羡明杰等[21]在研究中首次发现，嗜碱单胞菌新型羧基转移酶的α亚基基因Aa-accA与盐碱性关系密切。将该基因转移到大肠杆菌和烟草悬浮细胞BY-2中表达，结果表明该基因可提高大肠杆菌及烟草BY-2细胞的耐盐碱能力。嗜碱菌细胞壁含有大量酸性小分子，这些小分子带负电荷，可以中和细胞表面的H+。另外，细胞膜上的Na+/H+反向载体、K+/H+反向载体和ATP酶共同作用，也将H+排出细胞外，使pH值维持在适宜范围内。

5.2嗜碱菌的应用研究进展

刘文侠等[22]以兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillussp.N16-5作为表达载体，将外源基因导入其中，成功构建了2个嗜碱芽孢杆菌Bacillussp.N16-5表达载体，实现了外源基因在嗜碱芽孢杆菌中的表达。嗜碱芽孢杆菌是有机酸和碱性酶生产者，大多数的嗜碱微生物研究者都以此为对象。郭岩等[23]筛选出一株高效嗜碱好氧反硝化细菌BMEN1，在最适条件下，脱硝速率1h可达52.92mg/OD，且没有NO2-产生；在模拟烟道气吸收液进行的脱硝试验中，16h可完全脱除NO3-和NO2-（140mg/L），证明该好氧嗜碱反硝化脱硝细菌具有极大的应用价值。

6嗜压微生物

嗜压菌指依赖于高压条件才能良好生长的一类微生物，根据最适压力的不同，分为耐压菌、嗜压菌和极端嗜压菌三类。耐压菌指在0.10～40.53MPa下都能生长的微生物；嗜压菌在0.1MPa下也能生长，其最适生长压力为40.53MPa；极端嗜压菌生长在10000m以下，当压力低于40.53MPa时，压力成为其生长限制因子。嗜压微生物只存在于深海底部、地下煤矿和深油井等少数地方。

6.1嗜压机理

嗜压微生物能够在高压下生存，其细胞膜脂肪酸的组成、压力调控元件、呼吸链组成的多样性、嗜压基因的表达、嗜压酶的表达、运动特征等都与常压微生物有显著区别。

6.2嗜压菌的应用研究进展

嗜压微生物主要用于高压反应器和耐压酶的研制，嗜压菌是嗜压酶的主要来源。耐高温和可厌氧生长的嗜压菌有可能用于油井下产气增压和降低原油黏度，以提高采油率。

7展望

极端微生物具有许多优良特性，为人们开启了一片全新而广阔的应用前景，并将由此产生巨大的经济和社会效益。目前，极端微生物正日益在环境保护、食品工业、洗涤行业、医药行业、能源利用等方面显现出优势。极端微生物不仅可以作为天然物质的重要来源，也是新化合物的重要来源，如目前从嗜盐菌中发现的嗜盐菌素、抗生素、抗肿瘤活性物质、胞外多糖等活性物质；深海中存在的嗜热、嗜冷、嗜压等多种极端微生物，则是一些新物质的重要源泉。目前，人们对极端微生物的生理代谢、遗传及酶学还不十分清楚，加之极端微生物生长条件苛刻，难以培养和分离，有必要进行更深入细致的研究，使其更好地为人类服务。

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微生物多样性研究篇6

【关键词】微生物群落宏基因组时间序列

高通量测序方法的改进使得关于各种环境下微生物群落随时间变化情况的纵向研究大大增加。这些时间序列研究可以提供对于微生物群落稳定性的独特生态见解，同时也能了解无法以其他方式获得的微生物群落应对扰动的响应。

1通过时间序列数据了解微生物

在近期的纵向研究中，大约一半的微生物群落有负斜率时间衰减曲线，也就是说，这些微生物群落间的不同随时间增加为增加。此外，微生物群落多样性随时间变化的情况与环境有关，在相同的环境下，其多样性差异不大，在不同的环境中，微生物群落多样性差异很大。例如，土壤和酿酒厂废水中微生物多样性最低，然而人类手掌和婴儿肠道的微生物多样性最高。对海洋微生物进行的长期研究表明，相对与其他因素，微生物群落中的个别成员会受到季节变化的强烈影响。同时，另一些微生物群落在定殖后会经过一系列的可预测状态，例如在牙斑的形成过程中，耐氧菌的生存为厌氧菌提供环境。在某些情况下，例如婴儿肠道菌群的定植，虽然微生物群落在初始阶段变化连续变化，但最终会稳定在类似的状态。

微生物群落往往演变成一个稳定的组合状态，这一状态会受到外界因素的变化而变化，例如抗生素或益生菌治疗会影响肠道微生物群落的组合状态。微生物彼此之间及微生物与环境之间的复杂相互作用是影响微生物生态的主要贡献者，目前探索上述关系的方法主要是网络推断技术。

2微生物时间序列网络

近期的研究提供了许多可以从时间序列数据构建共生网络的方法，从结合置换检验的相关性分析[1]到基于超几何分布的相似性评估[2]，以及分析影响类群丰度多因素的多元回归分析[3]。这些静态网络推断技术可应用于构造动态模型。例如，微生物群落的动态变化在数学上往往符合广义的Lotka-Volterra方程，其将微生物丰度的变化作为分类群生长率和微生物间相互作用强度的函数。方程中的参数可以利用对时间序列数据进行多元回归确定。

然而，上述方法忽略了时间序列提供的时间点排序和依赖性的附加信息。这些特性只能通过动态的方式加以利用。

局部相似性分析（LSA）采用动态规划算法，在最大限度上确定两个序列的相似性得分，以判断两个序列的相似关系，同时LSA还可以检测两个时间序列之间关系的滞后。例如，LSA被用于预测噬菌体和他们的宿主之间的关系。动态贝叶斯网络在模型中将每个变量的当前值作为其父变量之前时间点的函数。因此，动态贝叶斯网络可检测包括循环在内的动态相关性，相比标准贝叶斯网络，动态贝叶斯提供了更强大的建模框架，尽管它增加了计算成本，可扩展性有限，然而在识别正确模型时其对数据的解释良好。另一组的动态网络推断技术基于交叉预测，它对如何通过同一系统内的其它时间序列预测某一的时间序列的将来这一问题进行量化，这类方法包括Granger因果关系[4]和新型聚合杂交映射。

上面提到的所有方法在推断物种相互作用时都从整个时间序列出发构造单一网络。然而，物种之间的相互作用可能随时间改变，因此其网络结构也会随之变化。时变网络推断技术的目的就是研究变化发展的网络结构，非平稳和随时间变化的动态贝叶斯网络，可用于推断在网络结构随时间发生的变化。

3结语

在微生物时间序列分析中，时间间隔的长短会影响微生物关联关系，纵向分析中的许多方法需要短期和定期采样间隔长的时间序列，目前可用的宏基因组时间序列往往很短（几个时间点），跳空（失踪的时间点），稀疏（零富）和嘈杂，因此需要进行预处理，包括：规范，插值和去趋势，使时间点等距等方法。因此如何更好的选取取样间隔是一个需要解决的问题。网络结构对状态转换的影响的研究尚处于起步阶段。未来的研究方向是探索随时间变化的网络是否有“预警”的属性，即网络结构可以预测某种转变是否发生。

尽管面临挑战，微生物时间序列的研究已经提供了一套丰富的分析工具，有助于了解系统动力学和应对扰动，构建预测模型。应用这些强大的技术于微生物学和宏基因组学，在解决遇到的纵向时间序列和相关建模难题上时有很大的帮助。

参考文献：

[1]吴松锋，朱云平，贺福初.转录组与蛋白质组比较研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2005，32（2）：99-105.

[2]李朝飞，于航，潘丽晶等.棉铃虫泛素基因的克隆及序列分析[J].中山大学学报：自然科学版，2005，44（1）：61-64.